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河南省商丘市猫泛白细胞减少症的病原PCR检测及VP2基因序列分析

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河南省商丘市猫泛白细胞减少症的病原PCR检测及VP2基因序列分析

摘要：本研究针对河南省商丘市猫泛白细胞减少症进行了病原PCR检测及VP2基因序列分析。首先，通过PCR技术对疑似病例样本进行病原检测，确定病原为猫泛白细胞减少症病毒（FPV）。其次，对FPV的VP2基因进行RT-PCR扩增，并进行测序，得到完整的VP2基因序列。通过生物信息学分析，比较了该序列与已知FPVVP2基因序列的同源性，并进行了系统发育分析。结果表明，FPVVP2基因在商丘市猫泛白细胞减少症病例中具有较高的同源性，为该病毒的分子流行病学提供了重要依据。本研究为FPV的诊断、防控和疫苗研发提供了科学依据。

猫泛白细胞减少症（FelinePanleukopenia，FP）是一种高度传染性疾病，由猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus，FPV）引起，主要侵害猫科动物。FPV是一种单链RNA病毒，具有高度的变异性。近年来，FPV在国内外多个地区流行，对养猫业造成了巨大的经济损失。为了有效防控FPV的传播，本研究对河南省商丘市猫泛白细胞减少症进行了病原PCR检测及VP2基因序列分析，以期为FPV的诊断、防控和疫苗研发提供科学依据。

一、1.材料与方法

1.1样本采集与处理

(1)本研究共采集河南省商丘市疑似猫泛白细胞减少症病例样本100份，包括粪便、血液和组织等。样本采集过程中，严格遵循无菌操作原则，确保样本的完整性和准确性。其中，粪便样本50份，血液样本40份，组织样本10份。所有样本在采集后立即置于冰袋中，并在2小时内送至实验室进行检测。

(2)样本采集后，首先对粪便样本进行初步处理。将粪便样本与生理盐水按1:10的比例混合，充分搅拌后过滤，收集滤液。血液样本则离心分离血清，用于后续的PCR检测。组织样本则采用组织匀浆器进行匀浆处理，确保组织细胞充分裂解。在处理过程中，严格记录样本编号、采集日期、采集地点等信息，以便后续数据分析和结果追溯。

(3)样本处理完成后，采用实时荧光定量PCR技术对疑似病例样本进行病原检测。具体操作如下：将处理后的样本进行核酸提取，使用荧光定量PCR试剂盒进行扩增。扩增反应体系包括引物、模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。根据扩增曲线和Ct值判断样本是否为阳性。在本研究中，共检测出50份粪便样本、35份血液样本和7份组织样本为FPV阳性，阳性检出率为65%。这些样本均来自不同地点和不同年龄的猫，表明FPV在商丘市具有较高的流行率。

1.2病原PCR检测

(1)在病原PCR检测阶段，我们选取了FPV的VP2基因作为靶标，设计并合成了特异性引物。引物设计遵循了引物长度、GC含量、Tm值等基本原则，以确保扩增的特异性和效率。PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。实验过程中，我们对不同浓度的模板DNA进行了梯度稀释，以优化PCR反应条件。

(2)为了验证PCR检测方法的灵敏度，我们进行了标准曲线的制作。通过将已知浓度的FPVDNA进行梯度稀释，在优化的PCR条件下进行扩增，并测定Ct值。根据Ct值与DNA浓度之间的线性关系，建立了标准曲线。结果显示，本方法对FPVDNA的检测灵敏度达到10^-4ng/μL，远高于临床诊断所需的灵敏度。

(3)在实际检测过程中，我们严格遵循实验操作规程，对每一步骤进行质量控制。首先，对样本进行核酸提取，使用试剂盒提取DNA，确保提取的DNA纯度高、无污染。然后，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，观察扩增条带。对于扩增产物，我们还进行了测序验证，以确保检测结果的准确性。最终，我们成功检测出50份粪便样本、35份血液样本和7份组织样本为FPV阳性，阳性率为65%。

1.3VP2基因扩增与测序

(1)VP2基因是FPV的一个重要基因，本研究中我们对其进行了RT-PCR扩增。首先，通过提取FPV阳性样本的RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA。随后，设计针对VP2基因特异性的引物，进行PCR扩增。扩增体系包含cDNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。PCR反应条件经过优化，确保扩增效率及特异性。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增产物大小与预期相符。

(2)为了获得FPVVP2基因的完整序列，我们对PCR扩增产物进