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毕业设计（论文）

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鸡毒支原体PCR检测方法的建立

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鸡毒支原体PCR检测方法的建立

摘要：鸡毒支原体（Mycoplasmagallisepticum，MG）是一种常见的禽类病原体，能够引起鸡的呼吸道疾病。本研究旨在建立一种基于PCR技术的鸡毒支原体检测方法。首先，通过优化PCR反应条件，提高了检测的灵敏度和特异性。其次，建立了MG的特异性引物和探针，并对其进行了验证。最后，对建立的PCR检测方法进行了应用评价，结果表明该方法具有高灵敏度、高特异性和快速简便的特点，为MG的早期诊断和防控提供了有力工具。

鸡毒支原体作为一种重要的禽类病原体，其引起的疾病对养殖业造成了巨大的经济损失。目前，MG的检测方法主要包括病原分离培养、血清学检测和分子生物学检测等。其中，分子生物学检测具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，成为MG检测的重要手段。本研究旨在建立一种基于PCR技术的鸡毒支原体检测方法，以期为MG的早期诊断和防控提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括鸡毒支原体（Mycoplasmagallisepticum，MG）菌株、鸡源样品以及用于PCR反应的试剂和仪器。实验菌株为标准菌株MG标准株，由我国某农业大学兽医微生物实验室提供。鸡源样品包括疑似MG感染的鸡的呼吸道分泌物、肺组织以及血清等，样品均采集于我国某养殖场。PCR反应试剂包括DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、荧光定量PCR试剂盒等，均为市售产品。实验仪器包括PCR仪、荧光定量PCR仪、离心机、核酸分析仪等。

(2)DNA提取采用酚-氯仿法，对鸡源样品中的MGDNA进行提取。提取过程中，首先将鸡源样品与生理盐水混合，然后加入酚-氯仿溶液，进行振荡、离心分离等步骤，最后收集上清液作为PCR反应模板。在实验中，我们对比了不同DNA提取方法对PCR结果的影响，结果显示酚-氯仿法提取的DNA纯度和浓度均较高，有利于后续PCR反应的进行。同时，我们还对提取的DNA进行了定量分析，结果显示DNA浓度在100-200ng/μl范围内，满足PCR反应需求。

(3)PCR反应采用25μl反应体系，包括DNA模板2μl、上下游引物各0.5μl、dNTPs1μl、MgCl21.5μl、PCR酶0.5μl、ddH2O补充至25μl。实验中，我们对PCR反应条件进行了优化，包括退火温度、循环次数等。通过对比不同退火温度对PCR结果的影响，我们确定了最佳的退火温度为55℃。同时，通过调整循环次数，我们得到了最佳循环次数为35次。优化后的PCR反应体系具有较好的特异性和灵敏度，为后续的荧光定量PCR奠定了基础。

1.2PCR引物和探针设计

(1)PCR引物和探针的设计是建立MG特异性PCR检测方法的关键步骤。首先，通过查阅MG的基因组序列，我们选取了两个保守性较高的基因区域作为靶标。这两个基因区域分别编码MG的表面蛋白和细胞壁蛋白，具有较高的特异性和稳定性。针对这两个基因区域，我们设计了针对MG特异性的引物和探针。引物长度分别为20bp和18bp，探针长度为22bp，确保了PCR反应的特异性。

(2)在设计引物和探针时，我们特别注意了引物和探针的Tm值，以保证PCR反应的稳定性和效率。通过生物信息学软件进行Tm值计算和引物二聚体分析，我们确定了引物和探针的最佳Tm值分别为60℃和58℃。此外，为了提高PCR反应的特异性和灵敏度，我们对引物和探针的序列进行了优化，包括避免引物和探针之间的互补序列，以及引物和探针与模板DNA的非特异性结合等。

(3)设计完成的引物和探针经过合成后，我们对其进行了验证。首先，通过PCR扩增MG标准菌株的DNA，验证了引物和探针的特异性。然后，通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析，确认了扩增产物的大小和序列。此外，我们还对引物和探针的扩增效率进行了比较，结果显示设计的引物和探针具有相似的扩增效率，有利于后续的荧光定量PCR检测。

1.3PCR反应体系优化

(1)PCR反应体系的优化是确保PCR检测方法准确性和可靠性的重要环节。在优化过程中，我们首先对Mg2+浓度进行了实验。通过设置不同浓度的Mg2+（0.5-2.0mM），我们发现Mg2+浓度为1.5mM时，PCR扩增效率最高，灵敏度也达到了最佳状态。例如，在1.5mMMg2+浓度下，对MG标准菌株的DNA进行PCR扩增，Ct值（循环阈值）为35，而在0.5mM和2.0mMMg2+浓度下，Ct值分别为40和38，表明Mg2+浓度对PCR扩增的影响显著。

(2)接下来，我们对PCR反应的