《原位PCR技术》课件.pptVIP

原位PCR技术原位PCR技术是一种用于检测特定DNA或RNA序列的分子生物学技术。它允许研究人员在细胞或组织中直接观察基因表达或基因组的改变。

简介细胞水平原位PCR技术可以在细胞水平上检测目标基因或序列，无需分离DNA。原位检测原位PCR技术直接在细胞或组织样本中进行DNA扩增和检测，保留细胞形态和组织结构。高度敏感与传统PCR相比，原位PCR具有更高的敏感性，可检测低拷贝数的目标基因。

原位PCR技术概述原位PCR技术是一种将PCR技术与显微镜技术相结合的分子生物学技术。该技术可以将目标DNA序列在细胞或组织的原位进行扩增，并通过显微镜观察扩增产物的分布和定位。

原理DNA扩增使用聚合酶链式反应(PCR)技术，在细胞内扩增目标DNA片段，以增加信号强度。原位反应PCR反应在细胞或组织的原位进行，保留了目标DNA的空间位置信息。探针标记使用荧光标记的探针与扩增后的DNA杂交，使目标DNA可视化。显微镜观察通过荧光显微镜观察，检测目标DNA的位置和分布。

实验准备1样品收集首先，要收集实验所需的样品，例如组织切片、细胞或血液样本。2试剂准备准备原位PCR所需的各种试剂，包括缓冲液、酶、引物、探针和核酸染料。3设备准备准备好实验设备，例如PCR仪、显微镜、恒温箱、离心机和移液器等。

实验步骤1样品准备固定、脱水、蛋白酶处理2原位PCR扩增靶基因3探针杂交标记信号4信号检测显微镜观察原位PCR实验步骤包括样品准备、原位PCR反应、探针杂交和信号检测四个主要步骤。

样品固定样品固定固定是原位PCR技术的重要步骤之一，它可以防止细胞和组织在后续操作过程中发生降解或变形。常用固定剂常用的固定剂包括甲醛、乙醇和戊二醛等，选择合适的固定剂需要根据样品类型和实验要求进行选择。固定时间固定时间应根据样品类型和固定剂的浓度进行调整，一般需要数小时甚至更长时间。固定后的处理固定完成后，需要将样品用缓冲液清洗，以去除残留的固定剂，并避免对后续步骤产生干扰。

样品脱水样品脱水是原位PCR技术中非常重要的一个步骤。它可以使细胞和组织中的水分蒸发，从而使细胞结构更加紧密，更容易被固定和染色。此外，脱水还可以防止细胞在后续步骤中发生变形和破裂。1低浓度酒精脱水使用低浓度的酒精溶液，如70%酒精，浸泡样品以去除大部分水分。2梯度酒精脱水将样品依次浸泡在不同浓度的酒精溶液中，例如80%、90%和100%酒精，以逐渐去除水分。3二甲苯透明使用二甲苯将样品中的酒精去除，使样品变得透明。

蛋白酶处理1细胞膜消化蛋白酶消化细胞膜，使DNA暴露2选择蛋白酶根据细胞类型选择合适的蛋白酶3控制消化时间避免过度消化，导致DNA降解4终止消化使用合适的终止液，阻止蛋白酶活性蛋白酶处理是原位PCR的关键步骤，它可以有效地消化细胞膜，使DNA暴露出来，以便于后续的扩增和探针杂交。选择合适的蛋白酶，控制消化时间和终止消化，是保证实验成功的关键。

原位DNA扩增混合反应液将包含引物、dNTP、Taq酶等试剂的反应液滴加到样品表面，覆盖目标区域。热循环进行热循环，使DNA聚合酶在目标区域进行DNA复制，扩增目标基因序列。重复循环多次重复热循环步骤，使目标基因序列得到大量扩增，并最终在原位产生可检测的信号。

DNA探针杂交1探针标记探针通常用荧光染料、生物素或放射性同位素标记。2杂交反应将标记的探针与扩增的DNA片段在适当条件下进行杂交。3洗涤去除未杂交的探针，以提高信号的信噪比。

信号检测1荧光显微镜观察信号2化学发光检测信号3显色反应生成颜色原位PCR后，通过不同的方法检测扩增产物。荧光显微镜观察荧光信号，化学发光法通过化学反应检测信号，显色反应则生成可观察的颜色变化。

原位PCR与传统PCR的比较11.反应体系原位PCR在固定的细胞或组织切片上进行，而传统PCR在试管中进行。22.反应目的原位PCR用于检测特定基因或序列在细胞或组织中的位置，而传统PCR用于检测样本中是否存在特定基因或序列。33.应用范围原位PCR主要用于研究基因表达、细胞分化、病原体感染等，而传统PCR主要用于基因诊断、基因克隆、基因突变检测等。44.灵敏度原位PCR的灵敏度一般低于传统PCR。

应用领域病原微生物检测原位PCR技术可用于检测各种病原微生物，如细菌、真菌、病毒等。它可以帮助诊断感染性疾病，并监测治疗效果。肿瘤细胞检测可用于检测癌细胞的存在和位置，并用于肿瘤分期和治疗。还可以用于监测肿瘤治疗效果，并评估肿瘤复发的风险。

临床诊断感染性疾病诊断原位PCR技术可用于诊断各种感染性疾病，例如细菌、病毒和真菌感染，并能确定感染部位。肿瘤诊断原位PCR技术可用于识别肿瘤细胞，并能确定肿瘤的类型和分期，从而指导治疗方案。遗传病诊断原位PCR技术可用于检测遗传性疾病的突变