细胞转染简介.ppt

G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可以将G418转变成无毒性状。第31页，共40页，星期日，2025年，2月5日当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。目前G418的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。第32页，共40页，星期日，2025年，2月5日关于细胞转染简介第1页，共40页，星期日，2025年，2月5日报告内容一转染的简介二转染的分类三转染的方法四转染后筛选第2页，共40页，星期日，2025年，2月5日一、转染的简介1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。

第3页，共40页，星期日，2025年，2月5日二、转染的分类瞬时转染稳定转染目的快速分析为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆目的DNA与宿主染色体未整合整合表达持续时间随细胞分裂而稀释至丢失48－72小时随宿主细胞本身基因组一样复制，转录，翻译，并被稳定遗传筛选办法抗生素抗性抗生素抗性第4页，共40页，星期日，2025年，2月5日三、转染的方法基因转染的基本方法可以分为：（1）重组子的构建（2）基因转染真核细胞的方法第5页，共40页，星期日，2025年，2月5日重组子的构建1.目的基因的制备和获取2.哺乳动物细胞表达载体的选择3.DNA片断的重组连接4.DNA重组体的鉴定第6页，共40页，星期日，2025年，2月5日1.目的基因的制备和获取(1)目的基因是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法第7页，共40页，星期日，2025年，2月5日A.限制酶切除a.从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。b.从真核基因组DNA制备c.从已克隆的DNA片段制备第8页，共40页，星期日，2025年，2月5日B.PCR或RT/PCR方法制备目的基因a.获取已知基因据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）→设计/合成一对引物→PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板)→从组织或细胞制备目的基因b.构建RT/PCR文库法获取未知基因据mRNA末端如polyA尾设计共同引物→将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→构成PCR－cDNA文库筛选第9页，共40页，星期日，2025年，2月5日C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。第10页，共40页，星期日，2025年，2月5日2.哺乳动物细胞表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。A.典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:a.启动子b.增强子c.多聚腺苷酸化信号d.药物选择标记基e.报告基因f.表位标签第11页，共40页，星期日，2025年，2月5日B.常用的哺乳动物表达质粒载体a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE第12页，共40页，星期日，2025年，2月5日2）病毒型载体病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。A．逆转录病毒载体逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基因组中，因而可以被稳定传代和表达。但