现代分子生物学实验原理与技术.pptVIP

加双蒸水至800ml，混合均匀。高温高压灭菌，室温保存。材料：煤气灯或酒精灯水平台面2)制作平板1铝箔纸直径9cm的培养基药匙试剂琼脂粉步骤：①胰蛋白酶8g酵母提取物4g三角瓶NaCl8g琼脂粉1L三角瓶2②铝箔纸封口，混匀，灭菌。③待冷却至60℃左右，分装至培养皿。④水平台上凝固。⑤倒置塑料袋中4℃保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷却至60℃，分装前加入。2、直径9cm的平皿，每皿25ml为宜。3、尽量缩短平皿开盖时间，分装的培养基很快凝固，因此操作要快。4、凝结在盖上的水珠可能至污染，故倒转存放。5、氨苄青霉素易失活，添加后的平皿应在数周内使用。第二节大肠杆菌培养无菌操作前用70%乙醇消毒台面。离酒精灯较近距离进行无菌操作。开盖前和开盖后用酒精灯灼烧瓶口2至3次。瓶口倾斜，不得垂直向上。使用平皿时尽量去除凝结在盖子上的水珠，并不得混淆盖子。1、培养1）小量液体培养材料：接种针或小木棒煤气灯2mlLB液体培养基长有细菌的平皿摇床1烧红接种针的铂金丝轻触平皿边缘挑起一个菌落灼烧试管口，开盖将铂金丝伸进液体培养基37℃震荡过夜用小木棒接种灼烧瓶口，取一根木棒木棒挑起单菌落同上步骤：①用接种针接种22)大量液体培养基材料：煤气灯摇床少量初始菌8mlLB液体培养基步骤：①小量培养数小时至过夜。②稍微打开盛有大体积培养液的三角瓶瓶盖，灼烧瓶口。③打开有初始培养菌的试管口，灼烧，将初始培养菌转入大量培养基中，盖上盖子，再灼烧瓶口。④37℃震荡过夜。3）菌落测定①在煤气灯旁用微量移液器吸培养液，转至Eppendrof管。②打开分光光度计，调整波长至600nm。③吸取未接菌的培养基至比色杯中，调整光吸收值为零。④取Eppendrof管内的菌液于比色杯中，测A600值。4）平板培养划线培养材料：接种针、煤气灯或酒精灯、新的LA平板、菌诱导期对数生长期平台期死亡期结果：A=0.2~1.0时为指数生长期，A＞1.0为平台期。A=1.0为10个/ml。8600600600步骤：①用煤气灯将接种针烧红，轻触平板一侧，冷却。②用铂金丝挑去平板上的单菌落，在培养基表面划线。③再灼烧铂金丝，冷却。④与前面所划线的一部分交叉划线，以减少菌数。⑤重复上步骤。⑥37℃倒置培养过夜。材料：新平板、圆形标签纸、牙签、封口膜或胶带、长有大肠杆菌的初始平皿步骤：①在平板底部贴标签，做标记。用牙签挑单菌落，接种到平板。37℃过夜后4℃保存。材料：涂布棒、新的平板、酒精灯或煤气灯、菌液步骤：①将平板翻转过来，置于盖上，50℃干燥20至30分钟。取100ul菌液，滴于平板上。用涂布棒涂布均匀。37℃倒置过夜。1、平板保存涂布培养第三节大肠杆菌菌株保存现代分子生物学实验原理与技术第一章绪论

第一节基因操作技术基因操作技术（重组DNA技术、基因工程）是在DNA水平上阐明生命现象的技术，包括DNA的“切”、“连”、“扩”等。“切”指限制性内切核酸酶切割DNA。“连”指用DNA连接酶连接两个DNA片段。“扩”是指目的DNA在宿主/载体系统中进行扩增。1.基因操作技术实验方案基因操作实验的主要目的有三个：分离目的基因，获取DNA信息；分析基因结构；分析基因功能。试验流程设计首先，应确定使用怎样的研究方案；其次，根据试验规模和研究室情况；最后，根据研究人员生活规律确定试验时间。3.实验方法

在设计实验方法时应考虑

①能否达到实验目的；

②是否符合实验室现状；

③是否符合自己的喜好。实验方法精度爱好实验目的经费预算实验周期仪器性能准确性速度确定实验方法时应考虑的因素4.实验遵循的原则①忠于实验流程④设平行对照实验②关注实验要点⑤准确的试剂用量③准备充足的实验材料⑥数据整理注意：⑴第一次实验成功，第二次实验马虎。⑵实验精度：①必须严格按照实验流程进行的操作；②较严格的实验操作，允许5%的变动；③允许20%变动的实验操作；