氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞.pdf

2010/11/07

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞

实验原理

转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、

分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方

法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种

细胞称为感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使

受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子

（即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbC

法。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。

本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，并用CaC处理，使其处于感受态，然后与

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pUC18质粒共保温，实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通

过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生

长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。转化子扩增后，

可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

实验方法

一、材料

DH5a菌种（生工），3m不含抗生素的LB液体培养基，100m不含抗生素的LB液体

培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaC，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块

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卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。

二、设备

移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50m离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，

30m注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。

三、试剂准备

1.LB培养基300m：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290m去离子水，加

入10mol/LNaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。

1)分装出100mlLB液体培养基（不含抗生素）。

2)分装3支3m的液体培养基。

3)其余200m用于制备LB固体培养基：分装3个50m，分别加入0.75g细菌培养用琼

脂。

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4)高压后降温至65℃，制备2块氨苄抗性LB固体培养基（加48μ氨苄抗生素），2块

卡纳抗性LB固体培养基（加200μ卡纳抗生素），2块无抗性LB固体培养基。

2.将准备好的LB培养基，甘油，2个50m离心管，80个1.5m离心管，高压。

3.Tris-CaC500m（75mmol/LCaC，10mmol/LTris.C，pH6.5）：称取CaC4.1621g，

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Tris0.6057g，先在烧杯中加约200m的ddHO用磁力搅拌器混匀，然后再加ddHO

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定容至500m，用盐酸调至pH6.5,最后再将配制好的Tris-CaC2吸入30m注射器中并

经0.45um针头滤器过滤，方可得到最终的Tris-CaC500m（75mmol/LCaC，

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10mmol/LTris.C，pH6.5）溶液。

4.卡那霉素：10mg/m溶于