聚合酶链式反应PCR.ppt

⑵复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40～60℃，30～60s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55℃30″，足以使引物与模板之间完全结合。第23页，共34页，星期日，2025年，2月5日⑶延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70～75℃。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，1Kb，1分钟足够；1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72℃1′。第24页，共34页，星期日，2025年，2月5日关于聚合酶链式反应PCR第1页，共34页，星期日，2025年，2月5日一、PCR的定义：PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。第2页，共34页，星期日，2025年，2月5日DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。第3页，共34页，星期日，2025年，2月5日PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。第4页，共34页，星期日，2025年，2月5日二、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。第5页，共34页，星期日，2025年，2月5日扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″2.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″第6页，共34页，星期日，2025年，2月5日3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72℃1′上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。第7页，共34页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8页，共34页，星期日，2025年，2月5日第9页，共34页，星期日，2025年，2月5日第10页，共34页，星期日，2025年，2月5日PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作