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毕业设计（论文）

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黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

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黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

摘要：犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，严重威胁着犬类健康。本研究旨在克隆黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因，并对其进行序列分析，以揭示其分子特征和变异情况。通过RT-PCR和克隆技术，成功扩增出黑龙江地区犬瘟热病毒H基因片段，并进行测序和序列分析。结果表明，克隆得到的H基因序列与已发表的参考序列具有较高的同源性，但存在一些变异位点。本研究为犬瘟热病毒的分子流行病学研究和疫苗研发提供了重要数据支持。

犬瘟热是一种高度传染性病毒性疾病，对犬类健康造成严重威胁。犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是引起犬瘟热的病原体，其基因组编码多个蛋白，其中H基因编码病毒的主要表面蛋白。H基因的变异与病毒毒力、免疫逃逸和流行病学特征密切相关。近年来，我国犬瘟热疫情时有发生，特别是在黑龙江地区。本研究旨在克隆黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因，并对其进行序列分析，以期为犬瘟热病毒的防控提供科学依据。

一、材料与方法

1.病毒样本的采集与处理

(1)病毒样本的采集是在黑龙江省多个犬类养殖场进行的，采集对象包括疑似患有犬瘟热的病犬和健康犬。采集过程中严格遵守动物伦理规范，确保样本的获取符合相关法律法规。采集的样本包括血液、鼻拭子、粪便和唾液等，每个样本均采用无菌操作进行采集，并立即置于冰袋中保存，以减少病毒活性损失。

(2)样本采集后，立即进行初步的病毒检测，以筛选出可能含有犬瘟热病毒的样本。初步检测采用RT-PCR方法，通过特异性引物扩增病毒基因片段，检测样本中是否存在病毒核酸。阳性样本进一步进行病毒分离和鉴定，以确保样本的准确性。病毒分离采用细胞培养方法，将阳性样本接种于犬肾细胞（MDCK）上，观察细胞病变情况，以确定病毒的存在。

(3)病毒分离成功后，对分离得到的病毒进行形态学观察，使用电子显微镜观察病毒颗粒的形态和大小。同时，对分离得到的病毒进行分子鉴定，通过RT-PCR和基因测序技术，进一步验证病毒的种类和特性。在处理病毒样本时，严格执行生物安全操作规程，确保实验室工作人员和周边环境的安全。病毒样本的采集与处理过程中，注重样本的完整性和准确性，为后续的基因克隆和序列分析提供可靠的基础数据。

2.RT-PCR扩增H基因

(1)本研究针对黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因，设计了一对特异性引物。引物设计遵循犬瘟热病毒H基因序列保守区，通过生物信息学软件进行引物优化，确保扩增片段的特异性。引物合成后，对引物进行序列验证，以确保引物的准确性和扩增效率。RT-PCR扩增实验在荧光定量PCR仪上进行，使用含有RNA酶抑制剂和逆转录酶的RT-PCR试剂盒。首先，将病毒RNA模板进行逆转录，合成cDNA，随后进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行40个循环。扩增过程中，实时监测扩增曲线，以确保扩增效率的稳定性和特异性。

(2)为验证RT-PCR扩增结果的准确性和灵敏度，本研究设置了阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照使用已知犬瘟热病毒H基因的阳性样本进行扩增，阴性对照使用未感染犬瘟热病毒的细胞培养物进行扩增，空白对照则使用无RNA模板的阴性对照。扩增结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物的大小和条带清晰度。电泳结果显示，目的基因条带在预期大小范围内，且与阳性对照一致，而阴性对照和空白对照均未出现特异性条带，说明RT-PCR扩增结果准确可靠。此外，通过调整扩增循环次数，评估RT-PCR扩增的灵敏度，结果表明，该方法对犬瘟热病毒H基因的灵敏度达到1fg/μL。

(3)为进一步验证RT-PCR扩增结果的特异性和重复性，本研究对多个不同来源的犬瘟热病毒样本进行了扩增实验。实验结果显示，所有犬瘟热病毒样本均能成功扩增出预期大小的目的基因条带，而其他非目标病毒样本均未出现特异性扩增。此外，对同一阳性样本进行重复扩增实验，扩增结果的一致性表明RT-PCR扩增的重复性良好。本研究采用RT-PCR技术成功扩增出黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因，为后续的基因克隆、序列分析和变异研究奠定了基础。

3.克隆与测序

(1)克隆实验首先选取RT-PCR扩增得到的犬瘟热病毒H基因片段作为模板。将目的基因片段与克隆载体连接，构建重组克隆载体。连接反应在T4连接酶的作用下进行，连接条件为16℃连接4小时。连接产物通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定