核酸分子杂交技术分子生物学检验技术生物化学检验教研室课件.pptx

分子生物学检验技术核酸分子杂交技术生物化学检验教研室

学习目标掌握：1.核酸分子杂交的基本原理；2.核酸探针的种类分类，常用探针标志物。熟悉：核酸分子杂交的影响因素；核酸探针的检测方法。常用核酸分子杂交技术的基本原理，操作过程。了解：1.常用核酸探针标记方法的原理和特点；2.常用核酸分子杂交技术的临床应用。

目录核酸分子杂交的基本原理与分类01核酸探针种类、标记方法02核酸分子杂交技术03CONTENTS分子生物学检验技术CONTENTS

常用核酸分子杂交技术PART03

常用核酸分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子菌落杂交检测固定在膜上,经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子

分子杂交的一般程序待测核酸制备电泳滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号制备探针探针标记加入标记核酸探针

分子杂交的一般程序1.待检2.电泳3a.印迹3b.合成标记探针AddKlenow

DNAPolymerase,

randomprimers

andlabeled

nucleotides4.杂交5.洗膜、显影Klenow

FragmentKlenow

Fragment

Southern印迹杂交DNA/DNA杂交，将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。琼脂糖凝胶电泳印迹技术分子杂交技术

琼脂糖凝胶电泳分离DNA不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。根据分子的大小进行分离。

印迹技术将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维膜）上

毛细管虹吸法重物湿滤纸吸水纸玻璃板胶膜湿滤纸湿滤纸桥支持平台玻璃容器20×SSC

电转移

Southern杂交的应用用Southern检测物种1和物种3的特异性的DNA片段从样本中提取DNA123

Southern杂交的应用限制性内切酶酶切DNA123

Southern杂交的应用消化后DNA经琼脂糖凝胶电泳分离123

Southern杂交的应用消化后DNA经琼脂糖凝胶电泳分离，经印迹技术转到尼龙膜上123

Southern杂交的应用附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交123

Southern杂交的应用经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段123

Southern杂交的应用分离转移杂交放射自显影酶切

流程图制备基因探针杂交根据杂交片段显示的长度多态性分析限制性内切酶MstII待检测基因，不同长度片段

Southern杂交的应用如何用Southern印迹诊断镰刀型红细胞贫血症的？镰状细胞贫血症临床表现慢性溶血性贫血易感染再发性疼痛危象

发病机制β珠蛋白基因镰刀型HbS缬氨酸GTGCACβ珠蛋白基因正常HbAGAGCTC谷氨酸

缺失了一个MstII酶切位点（回文结构）Southern杂交的应用ATΧA

Southern杂交的应用CCTAGGCCTGAGGACCTAGG==MstIIMstIIMstII5’3’1.15kb0.2kbCCTAGGCCTGTGGACCTAGG==MstIIMstIIΧ3’5’1.35kb

提取待检者全基因组DNA12Southern杂交的应用341234

MstII酶切后电泳分析Southern杂交的应用1.35kb1.1kb0.1kb0.6kb0.8kb0.3kb1.4kb

与β-珠蛋白基因特异性探针杂交Southern杂交的应用βA/βAβA/βSβS/βSβA/βS24131.35kb1.1kb0.2kb

Northern印迹杂交/NorthernblotNorthern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。是由Alwine于1977年建立的。

Northern印迹杂交/Northernblot基本原理和基本过程与Southernblot基本相同。01鉴别RNA。02探针可用DNA或RNA片段。03待测样品为总RNA或mRNA。04

Northern印迹杂交/Northernblot变性电泳提取组织总RNA转膜预杂交制备探针探针设计标记探针纯化探针Northern杂交杂交后检测结果分析

Northern杂交的应用待检样品分离纯化RNA逆转录PCR与丙型肝炎特异性探针进行点杂交HCVRNA病毒检测

Western印迹杂交/Westernblot1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测——免疫印迹，Weste