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灵芝三萜的测定

A.1高效液相色谱（HPLC）法

A.1.1原理

样品中三萜物质经乙醇加热回流提取，高效液相色谱法分离，紫外检测器检测，外标法定量，灵芝

三萜含量以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸G、灵芝酸H和灵芝烯酸B、灵

2

芝烯酸C、灵芝烯酸D总量计。

A.1.2试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

A.1.2.1试剂

A.1.2.1.1无水乙醇（CHCHOH）。

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A.1.2.1.2甲醇（CHOH）：色谱纯。

3

A.1.2.1.3乙腈（CHCN）：色谱纯。

3

A.1.2.1.4磷酸（HPO）：优级纯。

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A.1.2.2试剂配制

A.1.2.2.1流动相A（0.075%磷酸溶液）：吸取0.75mL磷酸，用水稀释并定容至1000mL，混匀，

过微孔滤膜（A.1.2.5.1）。

A.1.2.2.2流动相B（乙腈）：过微孔滤膜（A.1.2.5.1）。

A.1.2.3标准品

灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸G、灵芝酸H和灵芝烯酸B、灵芝烯酸

2

C、灵芝烯酸D标准品，2℃~8℃避光保存。标准品相关信息参见附录B。

A.1.2.4标准溶液配制

A.1.2.4.1标准储备液：准确称取按其纯度折算为100%质量的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵

2

芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸G、灵芝酸H和灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D各10mg（精确至0.1

mg），分别加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，得到浓度为1.0mg/mL的标准

储备液。2℃~8℃避光保存，有效期为3个月。

A.1.2.4.2标准系列工作液：分别移取0.05、0.10、0.20、0.40、0.50mL的各灵芝三萜标准溶液于5

mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混匀，配制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.10mg/mL混合标准系列工

作溶液。临用时配制。

A.1.2.5材料

A.1.2.5.1微孔滤膜：47mm×0.22µm。

A.1.2.5.2微孔滤膜：13mm×0.22µm。

A.1.3仪器和设备

A.1.3.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

A.1.3.2天平：感量分别为0.01g和0.1mg。

A.1.3.3涡旋混合器。

A.1.3.4平行浓缩仪。

A.1.3.5氮吹浓缩仪。

A.1.3.6研磨机。

A.1.3.7筛网：20目试验筛。

A.1.3.8回流装置。

A.1.4试样制备

取有代表性的灵芝样品，用研磨机粉碎后混匀，过20目筛，密封，冷冻保存。

A.1.5试样提取

称取1.0g试样（精确至0.01g）于150mL锥形瓶中，加入80mL无水乙醇（A.1.2.1.1），80℃加热回

流提取45min，过滤，合并滤液，平行浓缩仪30℃减压干燥，浓缩至约5mL，转移至刻度试管，氮气吹

干，加入1.00mL甲醇溶解，涡旋混匀，过微孔滤膜（A.1.2.5.2），供液相色谱分析。

A.1.6测定

A.1.6.1液相色谱参考条件

a)色谱柱：PhenomenexKinetexC18，3.0mm×150mm，粒径2.6μm，或相当者；

b)流速：0.3mL/min；

c)柱温：30℃；

d)检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；

e)检测波长：257nm；

f)进样量：10μL；

g)参考洗脱梯度：流动相A（0.075%磷酸溶液），流