《酵母双杂交自激活》课件.pptVIP

酵母双杂交自激活酵母双杂交系统是一种研究蛋白质-蛋白质相互作用的常用技术。自激活现象是酵母双杂交实验中常见的干扰因素，会导致实验结果的假阳性。

什么是酵母双杂交技术酵母细胞酵母双杂交技术利用酵母细胞作为媒介，来研究蛋白质之间的相互作用。DNA载体该技术使用专门设计的DNA载体，将目标蛋白与报告基因融合表达。实验操作通过将融合蛋白表达载体转入酵母细胞，观察报告基因的表达情况，判断目标蛋白是否相互作用。

技术原理酵母双杂交技术利用酵母菌的转录激活机制来检测蛋白质间的相互作用。将两个蛋白质分别融合到酵母转录因子GAL4的DNA结合域(BD)和激活域(AD)上，如果这两个蛋白质之间存在相互作用，则融合蛋白会形成复合物，激活下游报告基因的表达，从而检测到蛋白质间的相互作用。

实验步骤1:构建诱饵蛋白和猎物蛋白融合表达载体选择合适的载体首先，需要选择合适的表达载体，确保载体具有合适的启动子、终止子、多克隆位点，以及相应的标记基因。设计引物根据诱饵蛋白和猎物蛋白的序列，设计合适的引物，用于PCR扩增目标基因，并在引物中引入合适的酶切位点。PCR扩增使用设计好的引物，进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段，并进行琼脂糖凝胶电泳验证。酶切和连接将PCR扩增得到的DNA片段和载体进行酶切，然后连接，构建融合表达载体。转化和筛选将构建好的融合表达载体转化入相应的宿主菌，进行筛选，获得阳性克隆。

实验步骤2：将融合蛋白载体共转化酵母菌将构建好的诱饵蛋白融合表达载体和猎物蛋白融合表达载体共转化到酵母菌中。1选择转化方法常用的转化方法包括化学转化法、电转化法等。2制备酵母菌感受态将酵母菌培养至对数生长期，进行适当处理使其处于感受态。3转化融合蛋白载体将两种融合蛋白载体与酵母菌感受态混合，进行转化操作。4筛选阳性克隆通过选择性培养基筛选成功转化了两种融合蛋白载体的酵母菌克隆。转化后，需要在选择性培养基上筛选阳性克隆，即成功转化了两种融合蛋白载体的酵母菌克隆。这种方法的成功率取决于多种因素，例如酵母菌的感受态、载体的质量和转化操作的效率。

实验步骤3:在选择性培养基中筛选阳性克隆1配置选择性培养基缺少营养物质，只有转化了表达载体的酵母才能生长。2将转化后的酵母菌接种到选择性培养基上观察菌落生长情况。3挑取生长良好的菌落进行下一步的验证和分析。选择性培养基可以有效地筛选出转化了表达载体的酵母菌。在选择性培养基上，只有转化了表达载体的酵母菌才能获得所需的营养物质，从而得以生长。而没有转化表达载体的酵母菌，则无法获得生长所需的营养物质，无法生长。

阳性克隆的鉴定11.培养基筛选通过选择性培养基，筛选出能够在培养基中生长的酵母菌克隆。22.基因组提取提取阳性克隆的基因组DNA，用于后续的分子分析。33.PCR扩增使用特异性引物对目的基因进行PCR扩增，验证克隆的正确性。44.序列分析对PCR产物进行测序，确认插入基因的序列是否与预期一致。

自激活的鉴定空载体对照将空载体转化酵母菌，观察酵母菌的生长情况，判断是否具有自激活现象。报告基因表达检测通过检测报告基因的表达水平，判断诱饵蛋白是否具有自激活现象。显微镜观察观察酵母菌形态，以及报告基因表达产物的定位，进一步判断自激活现象。

自激活的机理分析自激活是指在酵母双杂交系统中，即使没有猎物蛋白的存在，诱饵蛋白也能激活报告基因的表达，从而产生假阳性信号。这通常是由于诱饵蛋白本身具有激活转录因子的功能，或诱饵蛋白与酵母细胞内的某些蛋白质发生非特异性相互作用，导致激活转录因子。理解自激活的机理对于提高酵母双杂交系统的可靠性和准确性至关重要。通过分析自激活的发生原因，可以采取相应的措施来避免或减少自激活现象，从而提高实验结果的可靠性。

自激活通路的应用蛋白质相互作用研究自激活通路可用于研究蛋白质之间的相互作用，识别新的相互作用蛋白。它有助于理解蛋白质的功能和信号通路，并为疾病研究提供新的靶点。基因功能研究自激活通路可用于研究基因的功能，包括基因的表达调控和基因突变的影响。它可用于研究疾病发生发展机制，并为药物开发提供新的思路。

自激活通路的相关研究深入探究机制科学家们一直在研究自激活的分子机制，例如蛋白-蛋白相互作用和转录调控。开发抑制剂针对自激活通路，研究者们正在寻找可以抑制其活性的药物或分子。应用于生物技术自激活通路的研究成果已被应用于生物技术，例如基因工程和药物研发。

自激活通路的特点高通量自激活通路可以快速筛选大量的蛋白质相互作用。可以使用高通量筛选方法，快速筛选出与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白。灵活性自激活通路可以应用于多种研究领域，例如蛋白质相互作用研究、基因功能研究、药物开发等。可重复性自激活通路实验结果重复性高，可以使用相同的实验方法，在不同的实验室得到相似的结果。灵敏度自激活通路可