目的基因表达.ppt

第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日5‘端甲基化的帽子为核糖体结合位点，和其40S亚基发生作用，40S亚基结合后沿链滑动到AUG处，此时核糖体组装完整（加上60S亚基），开始翻译。除此之外，一些mRNA（真核病毒和少数真核基因）在起始密码子上游还有IRES位点（internalribosomeentrysites，内部核糖体进入位点）。这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合（40S亚基P位点，起始蛋白质翻译）不同于原核生物的SD序列，IRES序列长度变化很大，从9bp到数百bp长，IRES的存在可以很方便的构建人工的真核操纵子，不同翻译强度的IRES序列，也为不同基因的表达协调提供了可选的元件。如果第一个ATG周围的序列符合KOZAK序列（NNNPuNNATGG),小亚基将会在此驻留较长的时间，从而更有利于组装成完整的核糖体，使翻译效率提高★第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日KOZAK是一个女科学家，她总结出在真核生物中起始密码子两端序列为：G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。Kozak序列为统计规律，第4位的偏好碱基为G，AUG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T。真核基因表达时通常在AUG前需设计GCCACC的kozak序列，或使用基因上游序列自带的kozak序列，避免核糖体出现leakyscanKOZAK序列NNNPuNNATGG★第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日4.2真核诱导表达体系对于组成型表达系统，常用来源于病毒的启动子和增强子，或者看家基因的启动子（如gapA/GAPDH的启动子）如SV40病毒早期启动子和增强子、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列—LTR(RSV)、人类巨细胞病毒等(CMV)。poly(A)加尾信号：AAUAAA真核表达载体含有两类组件：原核生物中使用的组件(包括复制子、抗性筛选基因和多克隆位点等)和真核宿主细胞中表达所需的转录调控元件（启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号(内含子两侧)序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列以及药物抗性基因等）第34页，共62页，星期日，2025年，2月5日无诱导物存在时表达水平低:既本底表达水平低或无泄漏诱导物存在时表达水平很高，且表达水平易受诱导物控制启动子系统不干扰宿主细胞的正常生理活动,系统不影响宿主中其它基因的表达，不易引起免疫识别诱导物易进入细胞，半衰期短，不易在体内残留理想诱导表达系统的特点内源诱导启动子热激启动子、金属硫蛋白启动子等重组诱导系统lac、tet阻遏蛋白系统激素类诱导系统FK506、RU486诱导系统第35页，共62页，星期日，2025年，2月5日(1)热激（诱导）启动子的机理(2)常用的热激启动子：4.2.1热激启动子热激转录因子heatshockfactor1(HSF1)：负责热激启动子的转录热激元件heatshockelements(HSEs)：HSF1特异结合在DNA上的序列热激（诱导）启动子一般含有2～4个热激元件和一个TATA区常温下HSF1为单体，高温条件下变为有调节活性的三聚体，并和HSEs特异结合而启动转录Drosophilahsp70Humanhsp70ThesoybeanheatshockpromoterGmhsp17.5-E★第36页，共62页，星期日，2025年，2月5日诱导机理的普遍性在真核细胞中普遍存在热激系统，HSF保守性高，不必额外表达转录因子基因表达快速高效hsp70Bpromoter:inductionratiosupto800-foldhumanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.响应时间：数十秒～数十分钟基因表达控制方便，对宿主细胞无伤害通过控制温度高低可实现基因表达水平的精细调节对基因表达的时间控制和空间控制非常适合基因疗法：腺病毒作为载体携带热激启动子控制的治疗基因感染正常细胞和癌细胞电磁辐射或聚焦超声波技术局部加热癌组织(3)热激启动子的特点★第37页，共62页