生物化学第二章蛋白质化学上.pptVIP

GSH的作用01解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；02参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；03保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；04维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。4一级结构研究测序前提：样品必须是均一的(纯度大于97%)必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内过程1.测定蛋白质分子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子的多肽链3.断开链内二硫键4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目?????5.鉴定多肽链的N、C瑞残基6.裂解多肽成小的肽段7.测各肽段的氨基酸序列8.重建完整多肽链的一级结构9.确定二硫键的位置N末端测定氨肽酶法：外切酶，但效果不好肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽→黄色DNP-氨基酸01二硝基氟苯（DNFB）法：（Sanger法）03生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来苯异硫氰酸（PITC）法：（Edman法）02用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的N末端逐个向里切。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶01也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。02氨肽酶法②C-端测定羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶Y羧肽酶C氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀GlnAsnCys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸羧肽酶法羧肽酶B可以切割C端的Lys或Arg羧肽酶B：只水解以碱性Arg和Lys为C-末端的肽键从羧基端开始向里逐一水解蛋白质但如果倒数第二个氨基酸为Pro两种羧肽酶均不能作用羧肽酶A可以切割C端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸本方法目前最有效。羧肽酶A：释放除Pro，Arg和Lys以外的所有C-末端残基01二硫键的拆分02氧化法：过甲酸03还原法：巯基化合物还原此外，还需要加8mol/L尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性；生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。酸水解：是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu；碱水解：多数氨基酸都被破坏，但Trp可定量回收0102氨基酸组成的测定两性解离和等电点氨基酸所带正负电荷相等，即静电荷为零时的溶液pH。氨基酸的等电点（isoelectricpointpI）等电点计算及意义公01式02推03导中性氨基酸（一氨基一羧基）pI=(pK1+pK2)/204logo酸性氨基酸（一氨基二羧基）pI=(pK1+pK2)/2碱性氨基酸（二氨基一羧基）pI=(pK’2+pK’3)/2电荷+0-pHpHpIpHH+H+﹤﹤阳离子兼性离子阴离子电荷0pHpI茚三酮反应pH5-7；80-100℃；茚三酮乙醇；蓝紫色化合物；570nm定量测定。脯氨酸；黄色化合物；440nm定量测定。（谷氨酰胺、天冬酰胺；棕色化合物）OH2O（2）α-氨基参与的反应①成盐反应酸水解液中以盐酸盐形式存在（碱中金属盐）②与亚硝酸反应Vanslyke氏氨基氮测定原理。N2一半来自氨基酸，另一半HNO2。该反应也用来判断蛋白质的水解程度。R—CH—COOH+HClNH2R—CH—COOHNH2·HCl甲醛滴定由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后，使氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。意义：定量测定；判断反应进程。12与2，4二硝基氟苯的反应（Sanger反应）弱碱；干燥；暗处；室温；形成黄色DNP-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，并与标准的DNP-氨基酸作比较。与苯异硫氰酸（PITC)（Edman反应）弱碱条件反应；衍生物是无色的，酸性条件下极稳定，可溶于乙酸乙酯，经高压液相即可分析出其N端的氨基酸组成。生成的肽链比原来少一个氨基酸，可以进行下一轮反应，而不需要彻底水解掉，此法是自动氨基酸分析仪的基本原理。与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应5-二甲氨基萘-1-磺酰氯酸水解生成的DNS－氨基酸（具有荧光），用乙酸乙酯抽提DNS－氨基酸，用色谱法分析或直接用纸电泳或薄层层析