细胞培养及材料细胞毒性检测.pptVIP

抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。配制具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。胰蛋白酶溶液消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。消化时间：水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。主要作用：用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌。常用浓度：0.25%物品湿热干热过滤紫外化学气体消毒剂电离辐射培养室工作台＋＋＋玻璃制品＋＋＋金属器械＋＋＋＋塑料制品＋＋＋橡胶制品＋＋＋＋培养用液＋＋布类棉类＋＋4.细胞培养的基本方法01贴附生长型细胞单击此处添加小标题02必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。单击此处添加小标题03粘着、粘附单击此处添加小标题04（attachment）单击此处添加小标题05铺展单击此处添加小标题06（spreading)单击此处添加小标题得到细胞组织块培养法消化培养法1）取材→切割01体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。弃去旧培养液→清洗→加入消化液→吸弃消化液→加入培养液→吹打分散细胞→分装稀释细胞→补加培养液→继续培养2）直接购买→培养02（原代培养）传代传代注意事项01添加标题接种数量为5×104～8×105个/ml。添加标题如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。04添加标题传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。0203添加标题培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。细胞传代的增殖生长过程0401020325%100%50%75%05125%游离期悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性细胞观察肉眼观察：培养液的颜色和透明度显微镜观察生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物细胞计数每毫升细胞数血细胞计数板细胞生长的指标细胞生长曲线贴壁率有丝分裂指数(MI)：分裂相数量占全部细胞数量的百分比细胞群体倍增时间四唑盐(MTT)比色法标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入量细胞活力测定细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比台盼蓝法四唑盐(MTT)比色法荧光素双乙酸酯法(FDA)四唑盐（MTT）比色法MTT比色法的原理：活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。细胞培养的其他指标细胞大小：显微测微计法细胞重量：称重法鲜重干重细胞固定与染色细胞固定苏木精-伊红染色Giemsa染色Feulgen染色考马斯蓝染色免疫法细胞核染色：Hoechst、DAPI**细胞培养

cellculture前言细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件细胞培养的基本方法细胞培养的污染和检测细胞冻存和复苏细胞管理及保藏细胞毒性检测主要内容1.前言WilhelmRoux(185