现代细胞生物学研究方法学生.pptVIP

泛素-蛋白酶体系统的作用途径Westernblotting

显示泛素化带型Sumoylation0102SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18％相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。SUMO化（sumoylation）的功能与泛素化(ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调节它们在细胞内的定位和分布.SUMO家族成员包括SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3。它们广泛存在于原生动物、后生动物、植物和真菌中，显示了SUMO在进化上的保守性。SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和碳端外延序列。在所有的SUMO家族成员中，甘氨酸－甘氨酸残基对SUMO结合是必须的。SUMO化蛋白SUMO-1的三级结构包括一个与泛素同源区域（氨基酸序列22－97）。这段序列紧紧的塞在泛素的一个superfold中，还有一个高度灵活的N端在类似泛素的中心突出。形成异肽键所需的甘氨酸残基在泛素和SUMO-1中是保守的。在体内，甘氨酸残基很容易被C－端水解酶分解。甘氨酸残基PositivechargedNegativechargedN-terminalPositivecharged甘氨酸残基C-末端残基C-末端残基当SUMO被E1活化酶活化时，其碳端的苷氨酸残基发生ATP供能的腺甘酸化；随后，在SUMO的碳端和E1的丝氨酸残基形成一个硫脂的结合，并释放出AMP。在这一酯基反应中，SUMO被转移到E2连接酶UBC9上；UBC9与SUMO硫脂的结合促进SUMO的碳端和底物蛋白的Lys残基形成一个牢固的异肽结合。有的SUMO底物蛋白需要E3联接酶来促进它们的SUMO化,有的不需要E3。一般E3酶都不直接与SUMO结合，它只结合UBC9和底物蛋白，从而促进SUMO与底物蛋白结合，完成SUMO化。SUMO的生物学功能1,调节蛋白之间的相互作用2,调节蛋白在核浆间的转运3,调节蛋白的转录活性4,拮抗泛素化，使蛋白稳定I-κB是SUMO的一个底物蛋白，它既能发生SUMO化，又能发生泛素化，而且由于SUMO化和泛素化的位点都是K21,SUMO会和泛素竞争结合位点。I-κB是NF-κB的抑制因子，NF-κB在胞浆中由于和I-κB结合呈现无活性的状态。I-κB经肿瘤坏死因子TNF的刺激，在S32和S36发生磷酸化，进而被泛素化。I-κB的降解使得NF-κB的入核序列暴露，从而进入细胞核激活NF-κB的靶基因。但是当I-κB被SUMO修饰后却能免受TNF诱导的降解，使NF-κB－I-κB－SUMO复合体继续稳定的存在于胞浆中，进而抑制NF-κB的转录活性。I-κBNF-κBSUMOUbiquitinationTNFNF-κBI-κBThree相差显微镜技术相差显微镜和普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后面安装一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起了放大的作用。最后，这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。最大优点：样品无需染色，可以观察活细胞流式细胞技术的应用

细胞分选

周期、凋亡测定

细胞表面蛋白定量

DNA渗入量测定

线粒体膜电位测定

流式细胞术定量分析

细胞凋亡率和细胞周期DAPI染色细胞流式细胞仪分析可用于分选细胞流式细胞术直接定量分析

细胞存活率PI（碘化丙啶）染色细胞，不能透过活细胞膜，但可以结合到死细胞的DNA碎片上。所以细胞表现出不同的荧光值。流式细胞术定量蛋白表达量关键点：抗体，相应的荧光素标记的二抗；流式细胞仪。蛋白表达量以面积表示。限制：仅用于膜蛋白含量的检测。流式细胞术检测细胞中

DNA合成量(BrdU法)荧光探针JC-1检测线粒体膜电位1JC－1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，具有电势依赖性积聚于线粒体内膜的特性。2它在线粒体上以单体和聚合体两种不同的物理形式存在。3JC－1特异地与线粒体内膜结合，只在线粒体膜电位崩解的时候才释放出来，因此，检验结果可靠，敏感性高。蛋白结构的分析STEP3STEP2STEP1利用Edman降解法直接测定蛋白质分子中的肽段序列，并拼接出蛋白质分子的全序列。根据蛋白质的cDNA序列的测定，推断出蛋白质分子的序列。质谱分析：通过酶解产生肽段片段，通过质谱仪分析肽指纹图谱，从而获得氨基