荧光细胞化学样品制备和检测技术.ppt

荧光染色方法浸染（组织或细胞固定在玻片上浸入染色缸，悬浮细胞在悬液中染色，再涂于玻片上），适用于染液较多，样品在玻片上固定比较牢固，染色时间需要比较长，染色均匀。01滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的组织或细胞上），适用于染液较少，样品在玻片上固定不是很牢固，染色时间较短。染色不易均匀，特别是时间比较长时，需添加染料。02漂浮法（组织片或培养黏附在一些膜上的组织细胞漂浮于染液上），适用于较大较厚的组织片，或黏附在一些膜上的组织细胞，染料使用相对较少。由于样品一般是反过来面朝下（染液面），所以特别注意不要在样品与染液间出现气泡。03用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽）。F-肌动蛋白是大多数真核细胞中以聚合丝形式存在的肌动蛋白。Phalloidin能与细胞内的F-actin特异性结合。激发光激发Phalloidin上结合的荧光标记，使F-肌动蛋白被观察到。FITC或Rhodamine标记的Phalloidin，溶于甲醇中制成贮存液（200u/ml），染色时终浓度为5u/ml。细胞涂片→PBS洗涤→2%戊二醛固定15分钟→PBS洗涤→0.2%TritonX-100抽提2分钟→PBS洗涤→FITC或Rhodamine标记的Phalloidin室温20分钟→PBS洗涤，观察。细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：FluorochromesandStainsDAPI,Hoechst,SYTO16:semipermeantandpermeantDNAstain,apoptosisGFP:usedinlivingsystemsasagene/proteinreporterLuciferyellow,Fluorogold:neuronaltracerMitoFluorgreen,MitoTrackergreen:mitichondrialmarker0102DiI:lipophilicmembranemarkerRhodamine6G,MitoTrackerred:mitochondrialandERmarkerPropidiumiodide,EthidiumBromide,SYTO25:impermeantandpermeantnucleicacidstainTO-PRO-3Alexa488Alexa568HumancoloncryptChristineAnderson,LaboratoryofProf.RayWhite,HunstsmanCancerInstitute,Utah细胞荧光离子探针游离钙离子含量测定：有Fura2AM,Indo1和Fluo3AM,前两者激发波长为紫外，而且均是双激发波长的比率荧光，所以目前一般在荧光显微镜观察，特别是激光共聚焦显微镜观察中用Fluo3AM。Ex/Em:506/526。Fluo3本身不发荧光，只有当与胞浆内游离钙离子结合后，受激发光照射才发出荧光。Fluo3AM不能与游离钙离子结合，但它能穿过细胞膜进入细胞内（Fluo3不能透过细胞膜进入细胞），进入细胞后的Fluo3AM中的AM被细胞内非特异性酯酶水解，变为Fluo3，Fluo3与细胞内游离钙离子结合，发出荧光。荧光强弱直接反应了细胞内钙离子的含量。Fluo3AM染色：Fluo3AM用DMSO配成贮存液，冰冻保存，使用时终浓度为1uM。染色一般为37℃，30~45分钟。Fluo3染色细胞内钙离子，可以通过时间扫描，进行细胞内钙离子含量和分布的动态观察。细胞内pH的测定：SNAFL：双发射波长比率荧光。Ex:514(488),Em:580/640BCECF：双激发波长比率荧光。Ex:490/440,Em:530PhysiologyProbesIndo-1,Fura-2:dualemissionordualexcitationcalciumprobeCalciumgreen,Fluo-3:singlewavelengthcalciumprobeBCECF:singleordualexcitationwavelengthpHprobeJC-1:potentialsensitivemitochondrialdualemissionCalcein:volumechanges,ga