荧光分光光度法与检测技术.pptVIP

第一节基本原理*荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。仪器类型滤光片荧光计滤光片-单色器荧光计荧光分光光度计第一节基本原理荧光分光光度计的基本结构*第一节基本原理光源2.4.7.9.狭缝激发单色器5.样品池表面吸光物质发射单色器检测器11.放大器指示器13.记录器第一节基本原理*光源目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）激发单色器发射单色器样品池测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器光电倍增管第一节基本原理仪器校准灵敏度校准波长校准激发光谱和发射光谱校准1221课堂互动请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别第一节基本原理点滴积累第一节基本原理*最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性依据，也是定量测定时的最适宜波长。强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。第二节荧光定量分析*第二节荧光定量分析由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。荧光强度与物质浓度的关系第二节荧光定量分析*当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸收光的强度：F∝（I0–I），用线性方程表示为：F=K′（I0–I）第二节荧光定量分析*K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：F=2.303·φF·I0·ε·c·L入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：F=Kc第二节荧光定量分析*1当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。2但只有当荧光物质的浓度很小时，3即ε·c·L≤0.05，这种关系才成立。课堂互动请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度比紫外-可见分光光度法要高？第二节荧光定量分析第二节荧光定量分析*定量分析方法01标准曲线法02配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液，分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲线。03然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准曲线上查找对应的浓度cx。04第二节荧光定量分析比例法若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx），然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：第二节荧光定量分析01多组分混合物测定与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广泛。02点滴积累第二节荧光定量分析*当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。第三节应用与发展一、荧光分析的应用（一）有机化合物的荧光分析芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系在紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。第三节应用与发展分析化学（第2版）谢庆娟李维斌全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划教材分析化学（第2版）谢庆娟李维斌全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划教材分析化学（第2版）谢庆娟李维斌全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划教材分析化学（第2版）谢庆娟李维斌全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划教材分析化学（第2版）谢庆娟李维斌全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划