疫共沉淀原理及注意事项.pptVIP

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）单系金Y-X-抗X一实验原理以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？测定两种目标蛋白质是否在体内结合01确定一种特定蛋白质的新的作用搭档CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）02CO-IP应用与IP区别实验基本原理1.提取蛋白2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—ProteinA或G3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合agarosebead琼脂糖珠CO-IP原理图解proteinA/G-琼脂糖珠复合物ProteinA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上。ProteinA/G的作用及具体原理“捕获”抗体，形成复合物，抗体-目的蛋白-ProteinA/Gbeads非共价健结合ProteinA/G-garosebeads共价结合加样缓冲液-煮沸变性-离心ProteinA/Gbeads↓EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。优点（3可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物（1相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态（2蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响二CO-IP特征局限性01（1可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用02（2两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；03（3必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。04二CO-IP特征三实验流程提取细胞总蛋白↓↓离心，上清电泳(抗原抗体)准备PA珠子，PBS洗3遍↓PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)↓离心去PA珠子，取上清↓测蛋白浓度(BCA法)↓加一抗反应(4℃过夜)↓加PA珠子捕捉复合物(室温1h或4℃过夜)↓离心，收集沉淀，预冷RIPABuffer洗3遍↓上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子↓↓010203SDSWesternblotting分析质谱分析检测目的蛋白四实验结果分析SDS结果分析标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。WB结果分析”一抗一抗一抗(兔抗Actin)曝光后的蛋白条带二抗(辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影ECL试剂含有转印蛋白的PVDF膜++转印膜上蛋白检测示意图CO-IP与质谱分析流程实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上