种质离体保存.pptVIP

01第四节影响超低温保存效果的因素02材料的基本特性03冰冻保护剂的应用04再生技术05预培养与低温锻炼06解冻方法材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性、器官、组织或细胞的年龄以及生理状态等（特别是基因型）。010102植物细胞培养物的生长年龄，也是决定冻后细胞成活率的最重要因素之一。指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻力强，存活率高。02一、材料的基本特性预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以减少细胞内自由水含量，减轻冷冻伤害，提高抗冻能力。预处理措施:包括提高培养基的糖浓度、提高渗透压以减少细胞内自由水含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂，5-10％DMSO等冰冻保护剂。低温预培养：将材料于0℃以上低温、黑暗或弱光下离体培养几周，可明显增强其忍耐冷冻能力。123二、预处理和低温锻炼冰冻保护剂（Cryoprotectiveagent，CPA）也称抗冻剂，为植物低温保存必不可少。特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。作用：增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长。依据渗透性的有无，可将CPA分为两类：1渗透型2非渗透型34三、冰冻保护剂的应用渗透型冰冻保护剂特点：多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过程，达到保护材料的目的。种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）。不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响也有不同，如甘油适用于慢速冷却，DMSO容易渗入细胞，但有轻微毒性。01特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。02种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羟乙基淀粉(HES)等。非渗透型冰冻保护剂慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先置于0℃下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好。快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50～-10℃)，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤。通常的做法是把样品放入37～45℃温水浴中，待冰完全溶化后（约90s）立即移开。010201根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式：四、解冻方法另外，不同材料或方法采用的化冻方式也有不同：材料含水量：液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。材料的生理状态：生长季节中的材料，一般在37～45℃温水浴中快速化冻（500-700℃/min）比在室温下慢速化冻要好，而木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。保存方法：玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。五、培养及再生1.冷冻保存后细胞和器官活力的检测再培养法测定存活率存活细胞(或器官)数目解冻(或器官)数目存活率=×100%培养基:一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以利于材料的恢复生长。02培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周，再转入正常光照下培养。01经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心维护：2.培养及再生真空减压保存的原理是，降低气压，空气的各种气体组分的分压都相应降低。例如气压降至正常的1/10，空气中的02、CO2、乙烯等的分压也都降至原来的1／10。这时空气各组分的相对比例并未改变，但它们的绝对含量则降为原来的1／10，O2的含量只相当于正常气压下2.1％了。所以真空减压保存减压贮藏也能创造一个低O2条件，从而起到类似气调贮藏的作用。

还不只如此。进行真空减压处理能促进植物组织内气体成分向外扩散，这是真空减压保存更重要的作用。植物组织内气体向外扩散的速度，与该气体在组织内外的分压差及其扩散系数成正比；扩散系数又与外部的压力成反比。所以减压处理能够大大加速组织内乙烯向外扩散，减少内源乙烯的含量。例****第七章种质离体保存几个相关概念（见《园艺植物育种学》）1种质（germplasm）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。种质资源包括动植物的个体、器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的基因。2