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狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定

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狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定

摘要：本文旨在研究狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定。通过基因克隆、原核表达系统构建、蛋白纯化及Westernblotting等方法，成功表达了CDV-FOX-TA株核蛋白基因，并对其进行了鉴定。实验结果表明，CDV-FOX-TA株核蛋白在原核表达系统中得到了较好的表达，且表达产物具有良好的免疫原性。本研究为CDV-FOX-TA株核蛋白的进一步研究奠定了基础。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一种高度传染性的病毒，可引起犬类及其他哺乳动物发生犬瘟热。CDV病毒基因组编码多个结构蛋白和非结构蛋白，其中核蛋白（Nucleoprotein，NP）在病毒复制和组装过程中发挥重要作用。近年来，CDV病毒株的变异和流行给动物防疫工作带来了巨大挑战。因此，深入研究CDV病毒株的基因结构和蛋白功能，对于疫苗研发和疾病防治具有重要意义。本文以狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株为研究对象，对其核蛋白基因进行原核表达及鉴定，为CDV病毒的研究提供新的思路和方法。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的克隆、表达载体的构建、蛋白表达与纯化所需的试剂和仪器。其中，狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的克隆采用PCR技术，以狐源犬瘟热病毒基因组为模板，设计特异性引物，扩增出目的基因。PCR反应体系包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶等。表达载体的构建采用重组克隆技术，将克隆得到的核蛋白基因插入到原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组表达载体pET-28a(+)-CDV-FOX-TA-NP。蛋白表达与纯化所需的试剂包括IPTG、Tris-HCl缓冲液、SDS凝胶、Westernblotting试剂等。实验仪器包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Westernblotting成像系统、离心机、超声波破碎仪等。

(2)在实验过程中，我们使用了多种化学试剂，如PCR反应试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、蛋白纯化试剂盒等。这些试剂均为高纯度试剂，能够保证实验结果的准确性和可靠性。此外，为了确保实验结果的准确性，我们对实验过程中使用的试剂进行了严格的检测，包括纯度检测、活性检测等。在实验过程中，我们还使用了多种生物材料，如狐源犬瘟热病毒基因组DNA、原核表达载体、宿主菌等。这些生物材料均经过严格的质量控制，确保了实验结果的可靠性。

(3)在实验过程中，我们对实验环境进行了严格控制，以保证实验结果的准确性和可靠性。实验室温度、湿度、无菌条件等均符合实验要求。同时，我们对实验操作人员进行了严格的培训，确保他们在实验过程中能够正确、规范地进行操作。在实验过程中，我们还对实验数据进行了详细记录，包括实验时间、实验条件、实验结果等。这些详细记录为后续的数据分析和论文撰写提供了重要依据。此外，我们还对实验过程中可能出现的意外情况进行了预案制定，以保障实验的顺利进行。

1.2基因克隆与表达载体系构建

(1)基因克隆步骤中，首先以狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株基因组为模板，设计并合成特异性引物。引物设计遵循以下原则：保守区域高保守性、目标基因序列特异性、避免二级结构形成。PCR反应在50μL体系中进行，包括2μL模板DNA，1μL上下游引物，4μLdNTPs，1μLTaq酶，剩余体积用去离子水补充。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，然后进行35个循环（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟），最后在72℃延伸10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示约800bp的目的片段。

(2)重组表达载体的构建采用T4DNA连接酶将PCR产物与pET-28a(+)载体连接。连接体系为：2μLPCR产物，1μLpET-28a(+)载体，4μLT4DNA连接酶缓冲液，1μLT4DNA连接酶，剩余体积用去离子水补充。连接条件为：16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR验证筛选到阳性克隆。测序结果显示，重组质粒pET-28a(+)-CDV-FOX-TA-NP与预期序列一致。

(3)为了优化蛋白表达条件，我们进行了IPTG诱导表达实验。实验设置不同IPTG浓度（0.1、0.5、1.0、