疫组织化学技术.pptVIP

免疫组化技术PART1根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。?2、基本原理1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（技术）。目前几种常用免疫组化方法简单介绍免疫荧光方法?利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。免疫酶标方法是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等.。4、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western?blotting、ELISA的异同Western?blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western?blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。免疫酶标法下的两个实验流程简介一、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。?7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30min-1h。8）PBS冲洗，3分钟×5次。9）滴加SP（链霉亲和素过氧化物酶），室温或37℃孵育30min~1h。??10）PBS冲洗，3分钟×5次。??11）显色剂显色（DAB等）。?12）自来水充分冲洗。?13）可进行复染，脱水，透明，14）选择适当的封片剂封片。??二、二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度DAB-二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。是HRP结合物最常用的底物常在免疫组化,原位杂交,Western?blot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。?苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，同媒染剂（常用的是三价的铁或铝的盐）一起使用，能够