维电泳的蛋白质提取制备.pptVIP

7、酚类组分单击此处添加小标题通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白单击此处添加小标题通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白单击此处添加小标题PVP或PVPP吸收酚来清除酚组分单击此处添加小标题应用还原剂防止苯酚的氧化单击此处添加小标题用抑制剂灭活多酚氧化酶阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良阻碍蛋白进人IPG胶条先除去不溶物质8、不溶物质六、裂解液的组分基本成分：尿素、一种或几种去污剂尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中去污剂：确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合还原剂：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态载体两性电解质、IPGbuffer:通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性七、样品制备导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质可溶性样品血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀释后直接分析较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、超滤、TCA/丙酮沉淀浓缩样品2、组织样品组织在液氮中冷冻后破碎组织样品的异质性免疫亲和技术激光捕获微量切割技术（LCM）3、细胞体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液固体基质中培养的细胞：去除培养基质，PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，将附着在基质上的细胞直接裂解核酸含量过高，用不含蛋白酶的DNase/RNase混合物来处理样品4、样品分级添加标题目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质添加标题亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀添加标题蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性能的不同八、溶解理想的2-DE溶解应能达到破坏所有非共价结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多肽的溶解液样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使2-DE中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的点强度将下降必须允许去除可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质样品中蛋白质在2-DE过程中必须保持可溶性变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，使其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域尿素＋硫脲表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团CHAPS、SDS还原剂：在变性剂和表面活性剂联用的条件下，加用还原剂可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底含自由巯基的DDT、β－巯基乙醇、不带电荷的三丁基膦（TBP）增加样品溶解性手段第三章

二维电泳的蛋白质提取与样品制备制备目的完全溶解单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。解离单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。变性单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。还原蛋白选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分样品制备原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品通过超速离心清除所有的杂质加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白第一节细胞裂解方法温和裂解方法剧烈裂解方法用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白沉淀步骤清除影响二维电泳图谱杂质裂解液组分组成较简单样品渗透裂解血细胞、组织培养细胞低渗溶液悬浮细胞冻融裂解细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次一、温和裂解法组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物去污剂裂解1酶裂解法消化细胞壁溶菌酶细菌纤维素酶、果胶酶植物溶细胞酶酵母在等渗溶液中处理细胞2二、剧烈裂解法超声裂解法细胞样品通过切应力裂解细胞迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却弗氏压碎器（FrenchPressurecell）含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末研磨法固体组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液机械匀浆法细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻