细胞培养基本技术.pptVIP

细胞的传代体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。4并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶盖，放入培养箱中培养。04吸取2ml细胞悬液，接种于新的培养瓶内。05吸光培养瓶中的培养液01静置2-10min（显微镜下动态监测）,在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。03加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）02贴壁生长细胞传代方法：无菌操作注意事项无菌操作中的注意事项???在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。细胞培养基本技术1传代：2细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。4取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。3原代培养细胞培养的甚本概念细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫01原代培养期02传代期03衰退期原代培养细胞的生命归宿培养细胞的生长方式必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞悬浮生长：贴附生长：培养细胞的特性04对数生长期05停止期（平台期）01游离期02贴壁期03潜伏期每代贴附生长细胞的生长过程A游离期：B细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。C10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）BAC潜伏期般为6～24小时。此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-渗透压无污染无毒实验用品：自动双重纯水蒸馏器，纯水仪CO2培养箱酶标仪、微孔板震荡器耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管倒置显微镜液氮罐超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸实验准备压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广1电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃2器皿消毒3滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、4酶液等均采用滤过法除菌5超净工作台：为细胞操作提供无菌环境6紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料7培养皿和培养板等表面消毒8常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干清洁液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水1平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液2PBS：NaCl8.0g3KCl0.2g4Na2HPO4.H2O1.56g5KH2PO40.206加水至1000ml