酶的分离纯化 (2).ppt

**************一般将只能透过溶剂而不能透过溶质的薄膜视为理想的半透膜。当把相同体积的稀溶液（如淡水）和浓液（如海水或盐水）分别置于一容器的两侧，中间用半透膜阻隔，稀溶液中的溶剂将自然的穿过半透膜，向浓溶液侧流动，浓溶液侧的液面会比稀溶液的液面高出一定高度，形成一个压力差，达到渗透平衡状态，此种压力差即为渗透压。渗透压的大小决定于浓液的种类，浓度和温度与半透膜的性质无关。若在浓溶液侧施加一个大于渗透压的压力时，浓溶液中的溶剂会向稀溶液流动，此种溶剂的流动方向与原来渗透的方向相反，这一过程称为反渗透。

**Colloids胶体颗粒。*****************************************************三、酶的结晶结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。第126页，共146页，星期日，2025年，2月5日*晶体沉淀——分子排列有规则蛋白质沉淀非晶体沉淀——分子排列无规则（无定形沉淀）晶体内部有规律的结构决定了晶体的形成必须是相同的原子、离子或分子。过饱和溶液的形成是结晶的原推动力和首要条件。第127页，共146页，星期日，2025年，2月5日*（一）结晶的条件酶的纯度纯度越高越易结晶（50％）2.酶的浓度（恰到好处）浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3.结晶温度4.溶液pH5.离子强度6.晶核7.结晶时间第128页，共146页，星期日，2025年，2月5日*（二）结晶的方法1.除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体;2.不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。盐析法如，前述的有机溶剂法均可用于结晶等电点第129页，共146页，星期日，2025年，2月5日*常用的结晶方法：透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。第130页，共146页，星期日，2025年，2月5日*Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）一、设计分离纯化工艺的基本要求第六节纯化方案的设计与评价第131页，共146页，星期日，2025年，2月5日*二、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2.根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤3.根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳4.根据专一性结合的方法：亲和层析5.其它：吸附层析，疏水层析第132页，共146页，星期日，2025年，2月5日*第133页，共146页，星期日，2025年，2月5日*（二）纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。第134页，共146页，星期日，2025年，2月5日*三、纯化方案的评价（一）酶活力测定：酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率。第135页，共146页，星期日，2025年，2月5日*方法：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。第136页，共146页，星期日，2025年，2月5日*常用的方法：1.化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学