目的基因的获取.ppt

反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。a.OligodT引导合成法从3’-开始，无法到达5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－DNA杂交分子第55页，共78页，星期日，2025年，2月5日第23页，共78页，星期日，2025年，2月5日（2）黏粒载体不仅能克隆和增殖完整的真核基因，还可克隆和分析组成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。（3）YAC、BAC载体克隆大片断DNA的载体。可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划中，YAC被广泛地用于大规模基因组结构分析。第24页，共78页，星期日，2025年，2月5日最早用于基因克隆的载体。只能容纳比质粒分子量更小的片段。不能用于核基因组文库。适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。（4）质粒载体第25页，共78页，星期日，2025年，2月5日3.基因组文库构建的一般步骤（1）基因组DNA的提取关键:制备高分子质量的基因组DNA经典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去除分子质量杂质。在提取时必须尽可能地避免机械切割第26页，共78页，星期日，2025年，2月5日关键：断点完全随机，片断长度合适于载体连接（2）DNA克隆片段的制备超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断②酶切法：第27页，共78页，星期日，2025年，2月5日第28页，共78页，星期日，2025年，2月5日（3）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾②人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片断第29页，共78页，星期日，2025年，2月5日各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日5.基因组文库的扩增及保存（1）基因组文库的扩增①液体培养增殖法最简便混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80℃储存（加终浓度为25%的甘油）缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80℃保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日384孔板第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日②影印滤膜培养法失真最小，最麻烦用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（-80℃）保存。③制备已包装的转导性裂解物适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。第38页，共78页，星期日，202