细胞生物学实验技术.ppt

不同光线的波长PART12、制样技术超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。2）冰冻蚀刻freeze-etching单击此处添加小标题亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。单击此处添加小标题AYeastCell（二）扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。Scanningelectronmicroscope（SEM）工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。扫描电子显微镜原理人类红细胞酵母人类精子三、显微操作技术

micromanipulationtechnique01.在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。02.显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。03.显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。显微操作仪细胞化学技术第二节生物化学与分子生物学技术组织化学和细胞化学染色方法（histochemicalandcytochemicalstainingmethod）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。（二）显示方法联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。单击此处添加小标题单击此处添加小标题脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。单击此处添加小标题茚三酮反应：显示蛋白质。单击此处添加小标题Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。单击此处添加小标题金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。免疫细胞化学immunocytochemistry根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。三、放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。四、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。原位杂交（insituhybridization）。将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。第二章

细胞生物学实验技术METHODSANDTECHNIQUES本章内容提要第一节显微技术光学显微镜电子显微镜显微操作技术第二节生物化学与分子生物学技术第三节细胞分离技术第四节细胞培养与细胞杂交第一节显微技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。—、光学显微