细胞生物学常用技术.pptVIP

三、细胞培养技术（Cellculture）从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法invitro用培养细胞做实验invivo用动物做实验细胞培养的条件固体表面：培养瓶、培养皿培养基常见培养基：1640DMEM(3)无菌无菌操作：超净工作台、火焰消毒等培养液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）(4)其他温度37℃湿度100%CO2浓度5%细胞培养的传代原代培养:直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例扩大培养原代培养传代培养(保持分化特性)传代无限繁殖3.细胞系（Cellline）在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。变异细胞细胞系HeLa人宫颈癌上皮细胞3T3小鼠成纤维细胞相差显微镜观察培养中的HeLa细胞4.细胞融合（Cellfusion）（1）定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。异核体杂交细胞分裂（2）促融方法生物学方法：仙台病毒化学方法：PEG物理方法：电脉冲打孔仪（3）应用A细胞核和细胞质间的相互作用B膜蛋白的流动性（二）电子显微镜技术利用电子与固体样品作用时所发出的信息,对样品进行微区观察和分析的技术亚显微结构超微结构1.电子显微镜的特点高分辨率理论上d=0.002nm实际上d=0.1nm生物标本d=2nm高放大倍率1,000,000阴极阳极聚光镜（电磁透镜）物镜中间镜投影镜电镜照片照相底片真空、上下颠倒2.透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）(1)基本构造超薄切片的制备固定戊二醛:蛋白质锇酸:C=C(膜结构)B脱水上升梯度乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋单体树脂加温聚合D切片500–700?E重金属染色U(醋酸双氧铀)Pb(柠檬酸铅)NADP酶反应嗜锇反应TPP酶反应扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscopy,SEM）(1)原理二次电子(2)分辨率3-10nm(3)样品的制备A固定B脱水C干燥临界点干燥D染色AuPt透射电镜利用穿透标本的电子进行成像(散射)观察组织的二维切片观察组织的表面三维结构利用标本表面发射的二次电子成像扫描电镜010203040506扫描探针显微镜（Scanningprobemicroscope,SPM）扫描隧道显微镜使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。分辨率高可在非真空状态下工作直接观察大分子的三维结构原子力显微镜通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。样品无需具有导电性可在三态下工作活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞消化EDTA细胞间连接胰酶细胞外基质细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法制备单一细胞悬液组织单一细胞消化EDTA细胞间连接123胰酶细胞外基质401离心（centrifugation）02大