荧光定量PCR的原理及应用.pptVIP

Taqman技术原理是，利用Taq酶的5′外切酶活性，即天然的5′→3′核酸外切酶活性，裂解双链DNA5′端的核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有叉样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5′端标记一个荧光分子，3′端标记另一个荧光分子，其中3′端的荧光分子能够吸收5′端荧光分子的荧光信号，但当有特异的PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Taq酶的5′外切酶活性，将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例。因此，根据PCR反应液的的荧光强度即可计算出初始模板的数量。其主要不足是:1）采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本低较高；2）采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响；3）探针标记成本较高，不便普及应用实时荧光定量PCR原理及其应用1基础研究中基因表达丰度的测定；2差异基因的表达检测，基因型分析；3临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测；6法医的遗传学鉴定；5检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验；4环境监测，包括水质、空气的污染检验；荧光定量PCR仪的应用PCR的反应过程FluorescenceCycle实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（Real-timeQ-PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR中的三个概念01增长曲线(primarycurve)荧光阈值（threshold)CT值(CycleThreshold)01增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系CycleFluorescence荧光域值（Threshold）的设定域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。01每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。02一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。Ct值与起始模板的关系荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI01使用方便，可以应用于不同的模板灵敏，便宜优点：02与非特异性产物结合，但可以通过熔解曲线进行辨别缺点：SYBRGreen?I21熔解温度(Tm值)Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。MeltCurveAnalysisRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针（TaqmanProbe）双标记探针（TaqmanProbe）优点：对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势设计简单，准确性好缺点：只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高查询目的基因序列选择合适的荧光标记方法选染料法则购买SyBrGreenI或相应试剂盒；探针法则设计并合成荧光探针设计特异引物或探针荧光定量PCR实验技术路线引物设计的一般原则：产物长度在80-300bp之间产物GC含量在50-60%之间引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或CPrimer5.0=True荧光定量PCR实验技术路线实验时先对普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带特异的情况下才能采用染料法进行荧光定量PCR实验注意模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10~100倍引物浓度：0.4~0.9μM（一般略低于PCR引物量）荧光物质浓度：按说明书操作，根