组织DNA的提取与纯化.pptVIP

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。组织DNA的提取与纯化讲课内容概述1试验原则2实验操作及相关试剂介绍3注意事项4DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。01单倍体人类DNA平均相对分子量为6×1010道尔顿，相当于1.3×105kb。02一、概述DNA的分类有：真核DNA细菌DNA病毒DNA质粒DNADNA样品的来源：01组织–肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞血液细菌–培养细菌、质粒0201保证DNA一级结构的完整性02排出其他干扰性分子的污染二、实验原则相应抽提对象之外的核酸污染DNA抽提时，应避免RNA干扰对酶有抑制作用的物质有机溶剂、高浓度的金属离子等样品中存在的其他生物大分子蛋白质、多糖和脂类应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度干扰分子相关因素对于核酸的影响：01机械剪切力、高温剧热环境02过酸、过碱的反应体系03各种核酸酶降解效应04物理因素05化学因素06生物因素07操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控制实验温度08pH4~1009EDTA缓冲液10避免干扰因素的解决方法01简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。02【实验方法】物理方式：玻璃珠法超声波法研磨法冻融法化学方式：异硫氰酸胍法酚-氯仿抽提法碱裂解法生物方式：酶法三、实验操作及相关试剂介绍酚-氯仿抽提法提取组织组织匀浆水相(DNA,RNA)絮状沉淀(DNA,少量蛋白质,RNA)DNA裂解液苯酚-氯仿离心离心离心氯仿-异戊醇5mol/LNaCl冰无水乙醇75%乙醇TE裂解液抑制DNA酶活性1mol/LNaClpH值适宜DNA游离至水相，避免降解。1%SDS（十二烷基磺酸钠）阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。1mmol/LEDTApH8.010mmol/LTris-HClpH8.0苯酚-氯仿操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。（3:1，V:V）Tris-HCl饱和3.氯仿-异戊醇（24:1，V:V）经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。5mol/LNaCl使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐沉淀。反应体系为pH8.0时，DNA分子所带的电荷为负电荷。加入NaCl溶液后，Na+能够中和DNA外周的负电荷，减少DNA分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。冰：低温条件能降低分子运动，避免DNA破坏，而易于沉淀出DNA。DNA不溶于乙醇。乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。所以，之前须加入5MNaCl。5.冰无水乙醇6.75%乙醇洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性