酶工程酶的分离纯化.ppt

透析袋酶溶液蒸馏水第62页，共132页，星期日，2025年，2月5日透析装置和过程第63页，共132页，星期日，2025年，2月5日2、超过滤

利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。第64页，共132页，星期日，2025年，2月5日超滤膜——制备超滤膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有AmiconDiaflo系列等。

超滤器类型——有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。第65页，共132页，星期日，2025年，2月5日加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液超滤装置第66页，共132页，星期日，2025年，2月5日3、离心法

——离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。第67页，共132页，星期日，2025年，2月5日

（1）离心机的种类和用途

（2）沉降系数S

（3）离心方法的选择

差速离心

密度梯度离心

等密度离心

（4）离心条件的确定

离心力

离心时间

离心温度和pH值第68页，共132页，星期日，2025年，2月5日梯度离心密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大,向上逐渐减小蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60％，w/w）密度可达1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1-氯-2,3-环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400000。需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。第69页，共132页，星期日，2025年，2月5日4、凝胶过滤法

原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。第70页，共132页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤第71页，共132页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤第72页，共132页，星期日，2025年，2月5日TubesmarchinfromleftA280Fraction#第73页，共132页，星期日，2025年，2月5日部分使用的担体目前使用最广泛的担体材料：※交联后的葡聚糖凝胶※聚丙烯酰胺※琼脂※其它物料第74页，共132页，星期日，2025年，2月5日二、根据溶解度建立的分离方法

1、盐析(SaltingOut)法

2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀

法）

3、等电点沉淀法

4、共沉淀法

5、选择性沉淀法：第75页，共132页，星期日，2025年，2月5日1、盐析法

最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。

?加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数V=V0（S1-S2）/（1-S2）。

?直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。第76页，共132页，星期日，2025年，2月5日2、降低介电常数法

（有机溶剂沉淀法）

降低介电常数方法在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常数，使酶分子间的静电引力增加而发生沉淀。第77页，共132页，星期日，2025年，2月5日影响介电常数的主要因素：

——温度

——有机溶剂

——离子强度

——pH值：第78页，共132页，星期日，2025年，2月5日温度：

——在0℃下进行操作；有机溶剂必须冷至-15~-20℃，边搅拌边缓慢加入，沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲液溶解沉淀。第79页，共132页，星期日，2025年，2月5日

有机溶剂：

——常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇等第80页，共132页，星期日，2025年，2月5日离子强度

——大多数中性盐在低浓度时能增加酶蛋白的溶解并减少变性，在有机溶剂沉淀中加入5~10%（0.05mol）的硫酸铵有助于提高分辨率。第81页，共1