细胞工程-6细胞融合.pptVIP

灭活后的病毒颗粒结合到细胞表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37℃、1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。添加标题融合要在较高温度中进行，一般为37℃。添加标题凝集要在4℃中进行，几分钟内可见细胞聚集成小团。添加标题每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。化学融合剂诱发细胞融合它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。商品名卡波蜡Carbowax,分子量200－20000，靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多种。1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促进细胞融合，Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。电融合技术1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合法，简称电融合。电融合是指将亲本细胞置于交变电场中，使它们彼此靠近，紧密接触，并在两个电极间排列成串珠状，然后在高强度、短时程的直流电脉冲作用下，相互连接的两个或多个细胞的质膜被击穿而导致细胞融合。融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。优点：操作简单；适用范围广；无需外源因子；毒性低；融合率高；参数易控制；可用于微量细胞融合；可在显微镜观察下定向诱导细胞融合并直接挑选杂交细胞。缺点：仪器昂贵，在融合大小不同细胞时存在问题；在融合膜成分差异较大的细胞时存在困难（二）融合细胞的筛选细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。基于酶缺陷型细胞基于药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状的杂种细胞的筛选1.HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞杂种筛选HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（Aminopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种:需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶:（催化次黄嘌呤产生肌苷）主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻断FH2到FH4合成。基于HAT培养基的筛选系统H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷酸前体A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体HGPRT酶缺陷型细胞株（长期培养系）不能在HAT培养液中生长正常细胞体外生存能力有限，最终也将死亡融合细胞最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活*第四章细胞融合一、概述二、细胞融合的发现和发展三、细胞融合的意义四、自发融合五、细胞融合的机理六、诱导融合七、体细胞杂种的遗传八、展望、概述细胞融合（cellfusion）：是两个或更多细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。二、细胞融合的发现和发展在细胞体外培养技术出现后，Lambert首次报道体外培养的肿瘤细胞有10-2～10-6自发融合概率。1875年，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。1938年，Muller首次发现了体细胞间的融合现象——脊椎动物肿瘤细胞的多核现象。其后科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。单击此处可添加副标题1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。1962年日本学者Okada发现一种日本血细胞凝集病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。在此基础上，用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。以后人工诱导体细胞融合逐