病毒转基因技术原理腺相关病毒.ppt

第二部分基因打靶型腺相关病毒载体野生型AAV-2在Rep的作用下，定点整合于人19号染色体的AAVSl位点。重组AAV不含rep基因，定点整合的可能性极度下降。可以通过高MOI感染以及对细胞敏感的血清型的衣壳包装，可能增加AAV的单链DNA入核并与细胞染色体发生重组的几率。基因打靶型AAV载体依赖于DNA的双链断裂(doublestrandbreak，DSB)，AAV可通过同源重组修复DNA双链可介导包括插入、缺失、点突变等多种遗传修饰的细胞内的基因打靶。因此，基因打靶型AAV载体重点在于设计，载体序列与染色体靶基因序列的同源臂的匹配长度，将载体上待突变的基因放在中央。3~5%的感染细胞可以发生整合，显著高于转染或电穿孔方式获得的基因打靶频率，且在打靶中AAV介导的基因表达可以长期持续、并具有高度的保真性。第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日rAAV载体应用于基因校正、基因阻断治疗疾病或生产转基因家畜、用于农业和研究的大型动物等具有无可比拟的优势，如：介导的基因打靶的效率高达1％、高于质粒载体转染或电转化，宿主范围广泛，可利用的多种亚型等。主要缺陷是大约10％仍是随机整合、具有潜在的致死或致癌效应。研究显示可采用成体干细胞并在体外筛选特异打靶克隆用于疾病治疗。第二部分基因打靶型腺相关病毒载体第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日策略3细胞内整合表达第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日关于病毒转基因技术原理腺相关病毒第1页，共46页，星期日，2025年，2月5日第一节腺相关病毒简介生物学特性致病性与免疫性第2页，共46页，星期日，2025年，2月5日第一部分生物学特性血清型病毒结构病毒复制对理化因素的抵抗力第3页，共46页，星期日，2025年，2月5日血清型AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。通过签名PCR（signaturePCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50~80%AAV-2抗体在人群中检测出。第4页，共46页，星期日，2025年，2月5日转导不同组织器官的AAV最优血清型不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissuetropisms）第5页，共46页，星期日，2025年，2月5日病毒结构AAV-220–30nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（invertedterminalrepeat，ITR）第6页，共46页，星期日，2025年，2月5日ITRITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（Dsequence）。ITR中还具有Rep结合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一个末端解离位点TRS（terminalresolutionsite）等重要序列。ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。第7页，共46页，星期日，2025年，2月5日左端的ORF（Rep基因）可编码四个Rep蛋白，即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在T