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减蛋综合征病毒Knob-S蛋白的表达和免疫原性研究

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减蛋综合征病毒Knob-S蛋白的表达和免疫原性研究

摘要：减蛋综合征病毒（KnockoutEggDropSyndromevirus,KEDSV）是一种高度传染性病毒，对蛋鸡养殖业造成严重经济损失。本文主要研究了KEDSV的Knob-S蛋白的表达和免疫原性。通过基因克隆、表达纯化以及动物免疫实验，成功表达了Knob-S蛋白，并对其免疫原性进行了评估。结果表明，Knob-S蛋白具有良好的免疫原性，能诱导鸡产生特异性抗体和细胞免疫反应，为KEDSV的疫苗研发提供了理论依据。

减蛋综合征病毒（KnockoutEggDropSyndromevirus,KEDSV）自2006年传入我国以来，给蛋鸡养殖业带来了巨大的经济损失。KEDSV是一种由RNA病毒科呼肠病毒属的病毒，其致病机理复杂，涉及病毒基因的表达、复制、组装等多个环节。Knob-S蛋白是KEDSV的一个重要结构蛋白，具有免疫原性，是疫苗研发的重要候选蛋白。本研究旨在通过基因克隆、表达纯化以及动物免疫实验，探讨Knob-S蛋白的表达和免疫原性，为KEDSV的疫苗研发提供理论依据。

一、1.Knob-S蛋白的克隆与表达

1.1Knob-S蛋白的基因克隆

(1)在本研究中，为了获得Knob-S蛋白的基因序列，首先通过查阅相关文献和数据库，确定了KEDSV的Knob-S蛋白基因序列。随后，利用RT-PCR技术从感染KEDSV的鸡胚中提取总RNA，并成功扩增出Knob-S蛋白的cDNA片段。通过序列比对分析，确认扩增得到的cDNA片段与已知的KEDSVKnob-S蛋白序列高度同源，进一步验证了RT-PCR的准确性。最终，获得了约500bp的Knob-S蛋白基因片段。

(2)为了将Knob-S蛋白基因克隆到表达载体中，我们选择了pET-28a（+）作为表达载体。通过PCR扩增得到Knob-S蛋白基因片段，并将其与载体连接，构建了pET-Knobs重组质粒。在转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株后，通过PCR和酶切鉴定，成功筛选到含有Knob-S蛋白基因的阳性克隆。进一步，通过测序验证了重组质粒的正确性，确保了Knob-S蛋白基因的准确克隆。

(3)为了确保Knob-S蛋白在表达载体中的正确表达，我们在重组质粒中引入了T7启动子，以便在IPTG诱导下启动Knob-S蛋白的表达。在IPTG诱导下，我们对转化菌株进行了Westernblot检测，结果显示成功表达出Knob-S蛋白。通过SDS分析，观察到Knob-S蛋白的分子量约为60kDa，与预期相符。此外，通过His标签亲和层析纯化了表达产物，纯度达到了95%以上，为后续的免疫原性研究奠定了基础。

1.2Knob-S蛋白的表达与纯化

(1)在完成Knob-S蛋白基因的克隆与鉴定后，我们进行了Knob-S蛋白的表达实验。将重组质粒pET-Knobs转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，并在IPTG诱导下进行表达。经过优化表达条件，包括温度、诱导时间及IPTG浓度等，最终确定了最佳表达条件。在最佳表达条件下，通过Westernblot检测到Knob-S蛋白的表达量显著提高，表明Knob-S蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。具体来说，Westernblot结果显示，在IPTG诱导后2小时，Knob-S蛋白的表达量达到最高，约占总蛋白的20%。

(2)表达产物经过His标签亲和层析纯化后，纯度达到了95%以上。首先，将IPTG诱导表达后的细菌裂解液通过镍柱亲和层析柱进行纯化，去除非特异性结合的杂质。在层析过程中，收集了Knob-S蛋白的主要洗脱峰，并通过SDS分析确认了Knob-S蛋白的纯度。结果显示，纯化后的Knob-S蛋白条带清晰，无其他杂蛋白污染。此外，通过SDS定量分析，纯化后的Knob-S蛋白含量约为5mg/L，为后续的免疫原性研究提供了足够的蛋白量。

(3)为了进一步验证Knob-S蛋白的纯度和生物活性，我们对纯化后的Knob-S蛋白进行了SDS、Westernblot和ELISA等分析。SDS结果显示，Knob-S蛋白的分子量约为60kDa，与预期相符。Westernblot进一步确认了Knob-S蛋白的纯度，未检测到其他杂蛋白。ELISA分析表明，纯化后的Knob-S蛋白能够与鸡抗Knob-S蛋白抗体发生特异性结合，证实了Knob-S蛋白的生物活性。这些结果为后续的免疫原性研究提供了可靠的实验数据。

1.3Knob-S蛋白的纯度鉴定

(1)为了对Knob-