细胞分析与检测技术.pptVIP

单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时；操作步骤：21吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。操作步骤：组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。固定方法物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。010201金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。02Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。03联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。04脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。05茚三酮反应：显示蛋白质。显示方法免疫细胞化学immunocytochemistry是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：如辣根过氧化物酶。免疫金法（（Immunogoldtechnique）ABC法（Avidin-BiotinComplex）亲和素Avidin又称卵白蛋白，是一种分子量为68KD的糖蛋白。它与生物素Biotin(又称维生素H)之间会发生非共价性反应，具有高度亲和力。这种亲和力要超过抗体对大多数抗原亲和力100万倍。所以，Avidin对Biotin的结合是不可逆的。同时,?Avidin有4个结合位点可与Biotin结合。因此,在免疫酶技术中可利用Avidin与Biotin之间的这种反应特性，以Biotin标记抗体或与酶结合,再通过Avidin-Biotin的架桥把酶与抗体连接起来,以提高检测方法的敏感度。ABC法（Avidin-BiotinComplex）免疫荧光技术利用某些荧光素，如FITC、R-PE(R-phycoerythrin藻红蛋白)等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。细胞膜蛋白分子的检测原理：细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量1细胞膜CD分子的检测（1）直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体4oC反应30-60min荧光显微镜观察或流式细胞计分析。（2）间接法：细胞＋抗CD分子的抗体4oC反应30-60min荧光素标记的二抗4oC反应30-60min荧光显微镜观察或流式细胞计分析悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色AnnexinV检测技术

(检测细胞凋亡的一个常规指标)1磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。2原理3（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。”（二）电子显微镜透射电子显微镜

transmissionelectronmicroscope,TEM原理以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。01由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空