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一种用于预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗及其制备方法

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一种用于预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗及其制备方法

摘要：本文研究了一种针对猫传染性腹膜炎（FelinePanleukopeniaVirus,FPLV）的mRNA疫苗及其制备方法。通过基因合成技术构建了FPLV的核衣壳蛋白（N蛋白）mRNA，并对其进行体外转录和质粒转染。构建的mRNA疫苗在猫细胞系中表现出良好的免疫原性，能够诱导特异性细胞免疫和体液免疫反应。本研究为FPLV的预防提供了新的思路和方法。

猫传染性腹膜炎是由猫细小病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPLV）引起的一种高度传染性疾病，对猫群的健康和养殖业的稳定发展造成了严重威胁。目前，FPLV的预防主要依赖于疫苗接种。然而，现有的灭活疫苗和亚单位疫苗存在免疫原性不足、保护效果不稳定等问题。近年来，mRNA疫苗因其独特的优势，如安全性高、免疫原性强、易于大规模生产等，成为疫苗研究的热点。本文旨在构建一种针对FPLV的mRNA疫苗，并对其制备方法进行深入研究。

一、mRNA疫苗的构建

1.1FPLVN蛋白基因的克隆与序列分析

(1)猫细小病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPLV）的核衣壳蛋白（N蛋白）是病毒颗粒的主要组成成分，对于病毒的组装和传播至关重要。为了构建针对FPLV的mRNA疫苗，我们首先对N蛋白基因进行了克隆和序列分析。通过设计特异性的引物，我们从FPLV基因组中成功扩增出N蛋白基因片段，其长度为840碱基对。通过生物信息学分析，我们确定了N蛋白基因的开放阅读框（ORF）起始密码子和终止密码子，并预测了N蛋白的氨基酸序列。N蛋白的氨基酸序列包含一个高度保守的核衣壳蛋白结构域，这与病毒颗粒的稳定性密切相关。

(2)在序列分析过程中，我们对N蛋白基因进行了BLAST比对，发现其与已知的FPLVN蛋白基因序列具有高度的同源性，同源性达到98%以上。进一步分析显示，N蛋白基因中存在多个潜在的B细胞表位和T细胞表位。为了验证这些表位的预测结果，我们构建了针对N蛋白基因编码的肽段，并利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了这些肽段对FPLV抗血清的反应。结果显示，大部分预测的B细胞表位和T细胞表位能够与抗血清发生特异性结合，表明这些表位在FPLV感染过程中具有免疫原性。

(3)为了进一步研究N蛋白基因的表达模式和功能，我们构建了表达N蛋白的重组质粒，并转染到猫细胞系中。通过免疫荧光检测，我们观察到转染细胞中成功表达了N蛋白，其表达水平与野生型病毒感染细胞相当。此外，我们还通过Westernblot检测了N蛋白的表达量，结果显示转染细胞中N蛋白的表达量显著高于未转染细胞。这些结果表明，N蛋白基因在猫细胞系中能够有效表达，为进一步研究N蛋白的功能和构建mRNA疫苗奠定了基础。

1.2FPLVN蛋白mRNA的体外转录

(1)在构建FPLVN蛋白mRNA疫苗的过程中，体外转录是关键步骤之一。我们采用了一种基于T7RNA聚合酶的体外转录系统，该系统具有较高的转录效率和稳定性。首先，将N蛋白基因克隆到T7启动子下游的质粒载体中，构建了表达质粒。随后，使用T7RNA聚合酶和相应的反应缓冲体系，在37°C条件下进行体外转录反应。经过优化，我们确定了最佳的反应条件，包括酶量、RNA模板浓度、反应时间和温度等。

(2)在体外转录过程中，我们采用了无酶水、10×转录缓冲液、dNTPs、RNA聚合酶、RNA模板和核苷酸修饰剂等试剂。通过实时荧光定量PCR检测，我们发现转录产物N蛋白mRNA的产量达到了100ng/μl以上，满足疫苗制备的要求。此外，我们对N蛋白mRNA的5和3端进行了序列分析，结果显示其与预期序列完全一致，没有发生脱氨基或修饰等变化。

(3)为了确保N蛋白mRNA的稳定性和有效性，我们对转录产物进行了纯化。采用DNaseI处理去除残留的DNA模板，并通过RNA纯化柱去除未结合的酶和杂质。纯化后的N蛋白mRNA纯度达到了RIN8.0以上，符合疫苗制备的质量标准。进一步，我们对纯化的N蛋白mRNA进行了稳定性测试，在-80°C储存条件下，其半衰期超过6个月，表明该mRNA疫苗具有良好的稳定性。

1.3FPLVN蛋白mRNA的质粒构建

(1)为了构建FPLVN蛋白mRNA疫苗，我们首先设计并合成了N蛋白基因的引物，确保其能够覆盖整个编码序列。通过PCR扩增，成功获得了N蛋白基因片段。随后，将扩增得到的N蛋白基因片段克隆到表达载体pCDNA3.1中，构建