蛋白质结合相互作用及研究方法.ppt

FRET常见的供体-受体荧光分子对：荧光蛋白类：染料类：CFP-YFPBFP-GFPBFP-YFPCFP-DsRFPGFP-DsRFPCFP-YFP-mCherry第63页，共100页，星期日，2025年，2月5日均相检测（无分离和洗涤步骤）实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势和缺点FluorescenceIntensityTimeLigandCy3Cy5荧光强度随时间衰减，有时间限制；采集信号有噪音缺点：第64页，共100页，星期日，2025年，2月5日假阴性问题转染效率，尤其是目标蛋白是膜蛋白时配对的供体和受体之间距离和方向不合适，即便形成复合物，FRET也不会产生；仪器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力假阳性的问题没有相互作用的供体和受体之间相隔很近的话，也可以发生FRET；所以，应结合多种蛋白相互作用的研究方法（如免疫共沉淀）FRET荧光能量转移应注意问题：第65页，共100页，星期日，2025年，2月5日FRET应用范围酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证蛋白质—核酸相互作用酶活性分析 离子通道研究蛋白质的结构研究第66页，共100页，星期日，2025年，2月5日TechniqueExtension-

Bimolecularfluorescencecomplementation

(BiFC,双分子荧光互补技术)

AVisualSystemtoInvestigateProtein-ProteinInteractionsBiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作用有重要意义。Huetal.,Mol.Cell9,789–798(2002).第67页，共100页，星期日，2025年，2月5日可以在最接近活细胞生理状态的条件下观察到相互作用的蛋白发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。第68页，共100页，星期日，2025年，2月5日四、细胞内共定位实验

(Cellularlocalization)直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布以及共定位的部位蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋白在细胞内的活动状态第69页，共100页，星期日，2025年，2月5日有色荧光蛋白标记技术步骤也可称为活细胞定位分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中共转染表达GFP/RFP融合蛋白confocalmicroscopy共聚焦显微镜法第70页，共100页，星期日，2025年，2月5日第71页，共100页，星期日，2025年，2月5日检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用一抗，二抗（荧光素标记）“靶蛋白一抗二抗”免疫复合物对照的严格设置利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位步骤第72页，共100页，星期日，2025年，2月5日第73页，共100页，星期日，2025年，2月5日其它研究方法的基本原理第74页，共100页，星期日，2025年，2月5日五、融合蛋白沉降技术(如：GSTPulldown)利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。第75页，共100页，星期日，2025年，2月5日GSTpulldown第76页，共100页，星期日，2025年，2月5日一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用；一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。融合蛋白沉降技术的应用第77页，共100页，星期日，2025年，2月5日操作简便，如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋白避免了使用同位素等危险物质。融合蛋白具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。融合蛋白沉降技术的优点第78页，共100页，星期日，2025年，2月5日该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白。