真核基因组DNA提取.pptVIP

实验原理想要制备基因组DNA，必须破碎细胞膜，去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性。010203在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶K消化真核细胞或组织并分解蛋白质，用SDS溶解细胞质并使蛋白质变性从而与DNA分子分离，使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合，在低盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来。实验步骤处死小鼠，取肝脏20-50mg，剪碎，加入1.5mL离心管内加入600μLLysisBufferA，振荡混匀加入10μL蛋白酶K，60℃水浴1h，其间颠倒混匀数次1.裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子组织块尽量剪碎，否则影响裂解及消化主要含有SDS（溶解细胞质并使蛋白质变性）EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）和Tris-HCl（缓冲体）消化降解蛋白质离心5min，将上清转入离心柱中，静置2min01加入400μLLysisBufferB，剧烈震荡30s03沉淀作用，内含有醋酸，提供低pH环境05加入10μLRNaseA，混匀，室温放置10min02核酸内切酶、去除DNA制品中的污染RNA04上清可能出现少量白色漂浮物，此为未消化完全的细胞和蛋白质062.DNA吸附在硅基质膜上，清洗去除盐等杂质12,000rpm离心1min，弃废液加入700μLWashbufferA，12,000rpm离心1min，弃废液加入700μLWashbufferB，12,000rpm离心1min，弃废液加入500μLWashbufferB，12,000rpm离心1min，弃废液再次12,000rpm离心2min，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37℃恒温箱放置5~10min，直至无明显乙醇味WashbufferA（含60%的乙醇）WashbufferB（含80%的乙醇）主要去除盐等杂质在硅基质膜中央加入50μLElutionBuffer（EB）(事先预热55～65℃)→置于室温2min→12,000rpm离心2min→所得液体即为基因组DNA溶液。01ElutionBuffer（EB）：主要是TEbuffer,提供高pH值环境，使吸附的DNA被洗脱下来013.洗脱DNA01材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。02由于真核生物基因组较大，操作时应注意轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。注意事项核酸（DNA及RNA）的鉴定及定量琼脂糖凝胶电泳法紫外分光光度法010203实验结果紫外分光光度法

—测定DNA的纯度和浓度原理：DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外光区具有较强的吸收,其吸收峰在260nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230计算其比值来衡量样品的纯度。dsDNA(双链DNA)浓度约为50μg/mL01RNA浓度约为40μg/ml03dsDNA浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50/100005ssDNA(单链DNA)浓度约为37μg/ml02寡核苷酸浓度约为30μg/ml04RNA浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×40/100006即OD260＝1时：浓度的计算纯度的检测DNA纯品的OD260/OD280约为1.8。OD260/OD280＞1.9说明含有RNA污染；OD260/OD280＜1.6说明有残余的蛋白质、酚等存在。OD230/OD260的比值应在0.4~0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。琼脂糖凝胶电泳法

—分离鉴定核酸的常规方法用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结构。结果观察：制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯下直接观察到DNA