MiR-615-3p_NUP62调控血管平滑肌细胞的表型和增殖迁移影响颅内动脉瘤形成的机制研究.pdfVIP

MiR-615-3p/NUP62调控血管平滑肌细胞的表型和增殖迁移影响

颅内动脉瘤形成的机制研究

摘要

目的：颅内动脉瘤(Intracranialaneurysm,IA)是一种神经外科的常见疾病，主要表现

为颅内动脉壁的异常瘤样突起。治疗方式包括动脉瘤夹闭术和介入栓塞术，但都伴

随着较多的并发症。通常认为IA的形成与内皮损伤、炎症及血管重塑等有关。其

中，血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)介导的血管重塑是一个显著

的病理特征。通过探索微小RNA(miRNA)中miR-615-3p在VSMC中的调控机制，

讨论miR-615-3p能否成为治疗IA的潜在靶点，从而为IA的治疗提供新的思路。

方法：(1)采集IA患者与健康志愿者的静脉血,提取血浆外泌体的RNA做高通量测

序并进行统计学分析。(2)通过基因本体(GeneOntology,GO)和京都基因与基因组百

科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)对miRNA的靶基因进行

功能注释和富集分析。(3)选取6个差异性表达最显著的miRNAs,通过实时荧光定量

聚合酶链式反应(Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction,RT-qPCR)检测它

们的表达，验证测序结果的准确性。(4)RT-qPCR检测人体IA组织和颞浅动脉组织

(STA)中miR-615-3p的表达；免疫荧光原位杂交实验(fluorescenceinsituhybridization,

FISH)检测miR-615-3p在组织中的表达及定位。(5)构建小鼠IA模型，比较假手术

(sham)组和IA组的颅底血管组织中miR-615-3p的表达情况；苏木精-伊红

(hematoxylineosin,HE)染色观察小鼠正常颅内血管与IA血管结构的变化。(6)不同

浓度梯度的HO处理VSMC，RT-qPCR检测miR-615-3p的表达；蛋白免疫印迹

22

(WesternBlot,WB)检测VSMC中收缩蛋白钙调钙素1(CNN1)和α-平滑肌肌动蛋白

(α-SMA)的表达情况；FISH实验检测miR-615-3p的亚细胞定位。(7)miR-615-3p

mimics转染VSMC，RT-qPCR验证过表达效率；在HO刺激下，miR-615-3pmimics

22

转染VSMC，WB实验、CellCountingKit-8(CCK8)实验、Transwell实验分别检测

VSMC的表型转化、增殖和迁移能力。(8)miR-615-3pinhibitor转染VSMC，RT-qPCR

验证敲低效率；在HO刺激下，miR-615-3pinhibitor转染VSMC，WB实验、CCK8

22

实验、Transwell实验分别检测VSMC的表型转化、增殖和迁移能力。(9)通过生信

预测、RNA下拉实验、双荧光素酶报告基因实验筛选出miR-615-3p的靶基因NUP62；

RT-qPCR和WB实验验证miR-615-3p与NUP62的负调控关系。(10)在HO刺激下，

22

同时敲低miR-615-3p和NUP62，WB实验、CCK8实验、Transwell实验验证在病

理情况下miR-615-3p是否通过NUP62调控VSMC的功能变化。(11)构建小鼠IA模

型，尾静脉分别注射antagomiR-NC和antagomiR-615-3p，溴酚蓝(BromophenolBlue,

BPB)明胶灌注观察颅底willis环的整体形态；HE染色观察血管的形态变化；马