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T细胞检测技术T细胞增殖分泌细胞因子细胞毒效应表达特定表面标志机体接受外来抗原及自身抗原刺激后，通过细胞免疫和体液免疫及相关系统协同作用，对抗原产生应答。T细胞应答：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松一、淋巴细胞增殖实验1、原理形态学检测检测方法优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。01缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。02方法学评价（2）3H-TdR掺入法（MTT法）PHA淋巴细胞（54h）3HTdR掺入（MTT被还原）收集细胞，检测β射线（490nm吸光度）优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。原理：CFSE等染料可连结到细胞内蛋白的氨基酸群（PKH26能插入脂膜），并随细胞分裂而分配到子代细胞中，每分裂一次，荧光强度减少一倍。方法学评价优点：操作简单；重复性强；安全；缺点：CFSE可能干扰细胞增殖CFSE（PKH26等）染色法010302二、T细胞分泌功能的检测T细胞经各种丝裂原或特异性抗原刺激后,分泌的各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，从而间接反映T细胞功能。对于依赖于该细胞因子而增殖的细胞，细胞增殖程度与细胞因子含量呈正相关。方法学评价优点：敏感（pg）；显示细胞因子的活性；缺点：影响因素多（同一细胞分泌多种细胞因子，多种细胞因子呈现相同功能，细胞因子及其相应受体同时分泌）；1、生物活性检测ELISA:操作简单，非特异性影响大；ELISPOT:高度的敏感性，可重复性强，抗原特异性精确；ICS：可同时检测产生细胞因子的细胞表型；需要样本量大于ELISPOT，破膜后的细胞不能做进一步功能检测；0203012、免疫学检测优点：简单，适用性广，应用特异的单克隆抗体，可检测单一细胞因子的含量；缺点：无法反应细胞因子的生物活性；不同单克隆抗体检测的结果不同；敏感性稍差（100pg）方法学评价12Realtime-PCR分子杂交2、分子生物学检测三、T细胞介导的细胞毒实验特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径，介导靶细胞溶解。铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形式被释放。方法学评价优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法；缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；1、51Cr释放实验ICAssay（InvivocytotoxicityAssay）表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后，皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。方法学评价优点：反应体内杀伤效果；缺点：影响因素多；