溶血空斑实验.ppt

第1页，共17页，星期日，2025年，2月5日实验目的掌握溶血空斑试验检测原理掌握溶血空斑的操作方法第2页，共17页，星期日，2025年，2月5日实验原理●溶血空斑实验（plaqueformingcellassay,PFC）体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法。●其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。第3页，共17页，星期日，2025年，2月5日●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。第4页，共17页，星期日，2025年，2月5日第5页，共17页，星期日，2025年，2月5日实验材料与试剂器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜试剂：①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.00×109个/mL第6页，共17页，星期日，2025年，2月5日②Hanks液（含Ca2+、Mg2+）③底层基（1.4%）和表层基（0.7%）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml④补体：新鲜豚鼠血清⑤小牛血清：56℃灭活30min第7页，共17页，星期日，2025年，2月5日实验步骤㈠免疫脾细胞悬液的制备①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108?个/1ml。②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为5×106个/ml）第8页，共17页，星期日，2025年，2月5日（二）倾注底层琼脂将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴锅中预温。第9页，共17页，星期日，2025年，2月5日（三）表层琼脂的制备将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：⑴20%SRBC悬液0.1ml。⑵小牛血清0.1ml。⑶5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育2h。第10页，共17页，星期日，2025年，2月5日（四）加补体从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。第11页，共17页，星期日，2025年，2月5日结果判定?观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。?第12页，共17页，星期日，2025年，2月5日