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研究报告

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兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp_E的构建及其免疫原性鉴

一、引言

1.1兔出血症病毒（RHDV）概述

(1)兔出血症病毒（RHDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染家兔和其他兔科动物。该病毒属于黄病毒科，是一种单股正链RNA病毒。RHDV的感染会导致家兔出现急性出血性败血症，死亡率极高。病毒主要通过直接接触感染动物或其排泄物、分泌物以及被污染的饲料和水源传播。RHDV的流行病学特征使其成为全球兽医领域关注的重点。

(2)RHDV的病毒粒子呈球形，直径约为30-40纳米。病毒基因组由约7.4千碱基对组成，编码三个结构蛋白（C、E和M）和多个非结构蛋白。其中，结构蛋白C和E是病毒感染的关键，它们分别参与病毒粒子的组装和释放。非结构蛋白则参与病毒复制和转录过程。RHDV的感染过程包括吸附、进入宿主细胞、病毒复制、组装和释放等步骤。

(3)RHDV感染后，宿主细胞会发生一系列病理变化，如细胞肿胀、核固缩、细胞凋亡等。这些病理变化导致组织器官功能障碍，进而引起兔出血症的临床症状。RHDV感染后，动物会出现发热、食欲减退、呼吸困难、腹泻、皮肤出血等症状。严重病例可出现脑炎、肺水肿和心肌炎等并发症，最终导致动物死亡。目前，针对RHDV的防控措施主要包括疫苗接种、生物安全措施和药物治疗等。

1.2多杀巴氏杆菌（M.hyopneumoniae）概述

(1)多杀巴氏杆菌（M.hyopneumoniae）是一种革兰氏阴性杆菌，属于巴氏杆菌科。该菌是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的主要病原体之一，对养猪业造成了巨大的经济损失。M.hyopneumoniae主要通过空气传播，感染猪群后，可引起猪只出现咳嗽、呼吸困难、生长迟缓和饲料转化率下降等症状。此外，该菌还与其他病原体协同作用，导致猪只免疫力下降，容易引发混合感染。

(2)M.hyopneumoniae具有多种致病机制，包括产生毒素、破坏宿主细胞膜、干扰细胞信号传导等。该菌在猪体内主要定植于呼吸道，如鼻腔、气管和肺泡。在健康猪只中，M.hyopneumoniae与宿主之间存在一种平衡状态，但当猪只受到应激、免疫抑制或其他病原体感染时，这种平衡被打破，导致疾病的发生。研究表明，M.hyopneumoniae的致病性与其表面荚膜多糖和脂多糖等成分密切相关。

(3)针对M.hyopneumoniae的防控措施主要包括疫苗接种、生物安全措施和药物治疗。疫苗接种是目前最有效的防控手段之一，可通过诱导猪只产生特异性免疫反应，降低感染风险。生物安全措施包括加强猪舍通风、定期消毒、避免引入带菌猪等。药物治疗方面，可使用抗生素进行治疗，但需注意耐药性的产生和合理用药。此外，通过改善饲养管理、提高猪只免疫力等措施，也有助于降低M.hyopneumoniae的感染风险。

1.3嵌合蛋白VP60-Plp_E的设计背景

(1)兔出血症病毒（RHDV）和多杀巴氏杆菌（M.hyopneumoniae）是两种对养殖业构成严重威胁的病原体。RHDV导致家兔的急性出血性败血症，而M.hyopneumoniae则引发猪的呼吸道疾病。这两种病原体感染后的症状相似，均表现为高热、呼吸困难和死亡。因此，开发有效的疫苗成为预防和控制这两种疾病的关键。

(2)研究发现，RHDV的VP60蛋白具有免疫原性，能够诱导宿主产生特异性免疫反应。同时，M.hyopneumoniae的Plp_E蛋白也是一种潜在的免疫原性蛋白。为了增强疫苗的免疫效果和广谱性，研究者设计了一种嵌合蛋白VP60-Plp_E，旨在结合两种蛋白的优点，以期望产生更广泛的免疫保护。

(3)VP60-Plp_E嵌合蛋白的设计背景还源于对现有疫苗的不足。现有的RHDV疫苗主要针对家兔，而对猪的保护作用有限。同样，M.hyopneumoniae疫苗在猪上的保护效果也不理想。因此，通过构建VP60-Plp_E嵌合蛋白，研究者期望能够开发出一种既适用于家兔也适用于猪的广谱疫苗，从而提高养殖业的整体健康水平。这种跨物种的疫苗开发策略，有望为动物疾病的防控提供新的思路和手段。

二、材料与方法

2.1嵌合蛋白VP60-Plp_E的构建

(1)嵌合蛋白VP60-Plp_E的构建首先需要从RHDV和M.hyopneumoniae中分别提取VP60和Plp_E蛋白的基因序列。通过生物信息学分析，确定两个蛋白的保守区域和相互作用位点，以便设计合适的连接序列。随后，利用分子克隆技术，将VP60和Plp_E基因序列分别插入到表达载体中，并构建成重组质粒。

(2)在构建过程中，为了保证嵌合蛋白的正确表达和活性，需要选择合适的表达系统。常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母和昆虫细胞等。本研究采用大肠杆菌表达系统，因