NLRP3通过调控肝细胞焦亡在对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的作用研究.pdfVIP

NLRP3通过调控肝细胞焦亡在对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的作

用研究

摘要

目的

对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）过量是造成急性肝衰竭最主要的原因

之一。NOD样受体蛋白结构域相关蛋白3（NOD-likereceptorproteindomainassociated

protein3，NLRP3）炎症小体激活在多种急性肝损伤中起关键作用，但其在APAP

诱导的肝毒性中的作用尚未得到深入研究。因此，本研究旨在探讨NLRP3炎症小体

在对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤模型（APAP-inducedliverinjur，AILI）中的作

用及机制，为AILI的临床治疗提供新的理论基础。

方法

本研究通过腹腔注射APAP构建AILI小鼠模型。通过苏木精-伊红染色

（Hematoxylin-eosinstaining，HE）评估肝组织病理学改变；通过免疫组织化学染色、

实时荧光定量PCR（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Westernblot）以及酶联免疫吸附

（ELISA）检测NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路的活化；在体外培养小鼠AML12

肝细胞系及小鼠原代肝细胞，通过westernblot和qPCR实验检测NLRP3信号通路

fl/fl△hep

在肝细胞中的表达情况，并通过CCK-8来评估细胞活力。此外，在Nlrp3和Nlrp3

+flox/flox

（AlbCreNlrp3）小鼠中分别构建小鼠AILI模型，通过注射致死剂量APAP比

较两者生存率；利用TUNEL染色检测肝组织凋亡情况，利用免疫组化染色、qPCR

以及ElISA检测小鼠肝脏炎症水平；利用免疫组化、westernblot和qPCR检测肝脏

组织中与增殖相关蛋白和基因的表达；在C57BL/6小鼠腹腔注射NLRP3小分子抑

制剂（MCC950）及GSDMD抑制剂双硫仑（Disulfiram，DSF）分别阻断NLRP3

和GSDMD，并通过HE、TUNEL染色和westernblot检测抑制剂的干预效果。

结果

1.AILI小鼠肝组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路显著活化。分离小鼠原代

肝细胞，westernblot结果显示AILI小鼠肝细胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD活化，肝

细胞发生焦亡。

2.在体外培养AML12细胞和小鼠原代肝细胞，实验结果显示，随着APAP浓度

升高，细胞活性下降，细胞中NLRP3/Caspase-1/GSDMD水平上升且成剂量依赖性。

3.与对照组（Nlrp3fl/fl）相比，肝细胞特异性敲除Nlrp3基因小鼠（Nlrp3△hep）

存活率显著升高，病理结果显示HE坏死区域减少，血清生化指标ALT、AST水平

下降，TUNEL阳性细胞率也显著降低。此外，肝组织中中性粒细胞（Ly6G）和巨

噬细胞（CD68）阳性细胞率显著减少，qPCR结果显示肝组织中炎症因子Tnf-α、Il-6、

Il-1β和趋化因子Mcp-1、Cxcl-1、Cxcl-2表达水平显著降低。

4.与对照组（PBS,Vehicle）相比，MCC950及DSF组血清生化指标ALT、AST

水平下降，HE结果显示肝组织坏死区域减少，TUNEL染色及Caspase-3的免疫组

化结果显示肝组织死亡细胞数量显著降低。此外，westernblot结果显示，MCC950

及DSF显著抑制APAP诱导的AML12细胞焦亡。

5.与对照组（Nlrp3fl/fl）相比，肝细胞特异性敲除Nlrp3基因小鼠（Nlrp3△hep）

肝组织中与增殖相关的蛋白PCNA、Ki67、CyclinD1和基因CyclinA2、CyclinD1、

CyclinE1表达显著增