生物技术生物工程植物细胞工程.ppt

细胞分裂与细胞壁再生愈伤组织形成愈伤组织分化植株再生（五）愈伤组织形成和植株再生第63页，共103页，星期日，2025年，2月5日1.提高变异频率2.细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合和基因转移必需在原生质体上进行。三原生质体培养意义第64页，共103页，星期日，2025年，2月5日体细胞杂交一）类型两大类：?对称融合（asymmetricfusion）－两个完整的细胞原生质体融合。?非对称融合（symmetricfusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。核失活－X射线，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸质失活－罗丹明（R－6－G，抑制线粒体氧化磷酸化。四、原生质体融合技术第65页，共103页，星期日，2025年，2月5日1．材料准备2．原生质体的制备3．融合方法PEG，电融合4．杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定5.细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生二）融合过程第66页，共103页，星期日，2025年，2月5日3．融合方法PEG，电融合二）融合过程按比例混合双亲原生质体→滴加PEG摇匀静置→滴加高钙高pH液，摇匀静置→滴加原生质体培养液洗涤数次→离心得原生质体细胞团→筛选再生杂合细胞。第67页，共103页，星期日，2025年，2月5日1）杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择4.杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定第68页，共103页，星期日，2025年，2月5日2）体细胞杂种的鉴定?形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。?细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。?生化鉴定：同功酶鉴定。?分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。4杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定第69页，共103页，星期日，2025年，2月5日RFLP基因型之间限制性片段长度的差异RAPD建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术4杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定第70页，共103页，星期日，2025年，2月5日第71页，共103页，星期日，2025年，2月5日原生质体培养1~3天，细胞壁再生再生细胞一旦分裂，继续生长1形成细胞团，发育成愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完整植株；2形成胚状体，再产生植株；5、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生第72页，共103页，星期日，2025年，2月5日1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究三）、融合技术应用第73页，共103页，星期日，2025年，2月5日２、微量元素母液的配制

MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是?CuSO4·5H2O、?CoCl2·6H2O?，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml

第31页，共103页，星期日，2025年，2月5日第32页，共103页，星期日，2025年，2月5日3、铁盐母液的配制

铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。

第33页，共103页，星期日，2025年，2月5日在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，FeS04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20-30min)，调pH值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。第34页，共103页，星期日，2025年，2月5日4、有机母液的配制

MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中。

配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。第35页，共103页，星期日，2025年，2月5日5、植物生长调节剂母液配制

一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：

（１）配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IB