DB21T 2619-2016 传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法.docxVIP

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DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2619—2016

传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法

Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus

2016-04-27发布2016-06-27实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2619—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。

本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：肇慧君，胡强，张雪，刘钊，栾慎顺，李叶，胡传伟。

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DB21/T2619—2016

传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法

1范围

本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）病原分离和环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。

本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样

SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范

3符号代号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CPE：细胞病变(cytopathiceffect)

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide）DEPC：焦炭酸乙二酯（diethypyrocarbonate）

EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicacid]RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱

Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]AMV逆转录酶：AMVreversetranscriptase

dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

4试剂、仪器和耗材

4.1试剂

4.1.1引物

选取特异性的IHNV的糖蛋白基因（G基因）的序列，设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：

外引物1（F3）：5′-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3′

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外引物2（B3）：5′-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3′

内引物1（FIP）：5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3′

内引物2（BIP）：5′-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTACGGATTT-3′

4.1.2BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

4.1.3AMV逆转录酶：15U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

4.1.42×reactionmixture：含40mMTris-HCL、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs。

4.1.5Rnaseinhibitor：40U/μL。

4.1.6显色液：浓度为1000×SYBRGreenⅠ。

4.1.7阳性对照：IHNV参考株。

4.1.8EPC细胞系：用M199培养液25℃培养。

4.1.9FHM细胞系：用M199培养液25℃培养。

4.1.10