密度梯度离心法取单个核细胞具体方法.pptVIP

密度梯度离心法取单个核细胞密度梯度离心法密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。密度梯度离心法不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。01介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；02密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。03密度梯度离心原理密度梯度离心可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。密度梯度离心法也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。蔗糖密度梯度离心法采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；PH中性或易调为中性；浓度大时渗透压不大；对细胞无毒。01020304分离活细胞的介质要求利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。目前比较常用ficoll密度梯度法。密度梯度离心法应用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法一、步骤1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝×104×2（稀释倍数）Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法4个大方格内细胞总数46.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。

活细胞百分率＝×100％

用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法活细胞数总细胞数Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法二、试剂和材料比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。Hanks液(无Ca２＋、Mg２＋)10％小牛血清RPMI16400.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。肝素用Hank‘s液或生