MicroRNA-484介导肝细胞铁死亡在非酒精性脂肪肝病中的作用.pdf

华中科技大学硕士学位论文

摘要

【背景与目的】随着全球肥胖人群越来越多，非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic

fattyliverdisease,NAFLD）发病率逐年攀升。一般来说，NAFLD是肝脏广泛损伤的

共同特征，狭义上讲，其分为病变较轻的非酒精性脂肪肝（Non-alcoholicfattyliver,

NAFL），和病变较重的非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholicsteatohepatitis,NASH），前

者以单纯的肝细胞脂肪变性为主，而后者在肝脏脂肪变性的基础上还有细胞炎症和

损伤，以及不同程度的纤维化；广义上讲，NAFLD还包括在NASH进一步演变为的

肝硬化和肝衰竭。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分

子，其长度约为22个核苷酸，可在细胞内外起到重要的基因表达调控作用。

MicroRNA-484（miR484）已被证实在多系统疾病中发挥着调控作用，而其在NAFLD

的研究仍较为少见。Sirtuins（SIRTs）是一个III型组蛋白去乙酰化酶家族，由7个

成员组成，广泛表达于哺乳动物中。Sirtuin2（SIRT2）作为SIRT家族的一员，其基

因位于常染色体19q13.2上，与细胞质中的微管蛋白共定位，主要在胰腺、肝脏、肌

肉、脑等组织器官中表达。目前已有大量研究表明SIRT2在糖尿病、脑血管疾病、

神经系统疾病、癌症等疾病中都发挥着枢纽性的作用。铁死亡（Ferroptosis）是一种

细胞内铁依赖性的细胞死亡，谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathioneperoxidase-4,GPX4）

是铁死亡病理过程中关键的调节蛋白，细胞内铁的过量蓄积是铁死亡的重要特征之

一。本实验通过建立NAFL和NASH小鼠模型，观察不同模型肝脏组织细胞学、肝

功能相关表现，同时对miR484、SIRT2、以及铁死亡线粒体表现及关键因子GPX4、

铁含量等进行测定分析，探索了miR484在NAFLD肝细胞铁死亡中的调节作用，并

推测该作用可能是miR484通过靶向调节SIRT2来实现的。

【方法】在获得野生型（Wildtype，WT）和miR484基因敲除型

（microRNA-484knockout，miR484KO）C57BL/10J小鼠的基础上，建立小鼠的正常

饮食组（normalchowdiet，NCD）代表对照组模型、高脂饮食组（highfatdiet,HFD）

代表NAFL模型、胆碱缺乏饮食组（methionine-andcholine-deficientdiet,MCD）代

V

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表NASH模型。各组小鼠命名分别为：野生-普通饮食组（WT-NCD）、野生-高脂饮

食组（WT-HFD）、野生-缺乏胆碱饮食组（WT-MCD）、敲除-普通饮食组（KO-NCD）、

敲除-高脂饮食组（KO-HFD）、敲除-缺乏胆碱饮食组（KO-MCD）。通过丙氨酸转氨

酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的血浆含量测定、肝组织HE染色及非酒精

性脂肪肝病活动性评分（NAS评分）来检测各组小鼠肝组织损伤；通过油红O染色

检测肝组织脂质沉积；通过透射电子显微镜观察对比各组小鼠肝组织细胞中线粒体

形态变化；通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（RT-qPCR）检测各组小鼠肝组

织中SIRT2的mRNA表达；通过蛋白质印迹实验测定各组小鼠肝组织SIRT2和GPX4

的蛋白质表达；通过细胞铁含量测定对比各组小鼠肝细胞内铁含量变化；通过双荧

光素酶报告实验验证miR484与SIRT2的直接靶向关系。

【结果】1、在野生型NAFL小鼠模型中，其肝脏组织结构紊乱，SIRT2表达减

少（P0.05），肝细胞铁死亡情况加重（P0.05）；在野生型NASH小鼠模型中，SIRT2

表达进一步减少（P0.05）、肝脏损伤及肝细胞铁死亡进一步加重（P0.05）。2、

MiR484KO小鼠中，NAFL组和NASH组相较于WT小鼠的对