高灵敏度遗传编码的cAMP荧光探针G-Flamp3的研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文

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摘要

环磷酸腺苷（CyclicAdenosineMonophosphate，cAMP）是细胞信号传导通路中

重要的第二信使。cAMP信号通路具有很强的调节性，广泛参与许多细胞生理过程

（如神经元可塑性和适应性免疫细胞活动）。活细胞和活体水平的cAMP高时空分辨

率荧光检测是解析cAMP信号传导通路和其生物学功能的关键，开发监测cAMP信

号分子的高灵敏度（大动态范围和合适的亲和力）探针已成为迫切需求。现有的基

于环化重排绿色荧光蛋白的G-Flamp1和G-Flamp2探针具有较高的亲和力（1~2μM）。

然而，在对静息cAMP浓度较低的细胞（比如神经元，1μM）的微弱刺激下或自

发cAMP活性震荡下，这些探针很难监测到cAMP的变化。因此，有必要进一步提

高G-Flamp探针的亲和力。本文在G-Flamp2的基础上，基于晶体结构进行高通量筛

选，优化得到了具更高灵敏度的第三代绿色探针G-Flamp3。主要结果如下：

（1）基于荧光蛋白的cAMP探针的突变及优化。在G-Flamp2的基础上，分

别对绿色荧光蛋白的N端、感应模块MlotiK1通道的cAMP结合结构域（MlotiK1

CyclicNucleotideBndingDomain，mlCNBD）的C端、探针的重要位点进行突变，

筛选得到G-Flamp3突变体。

（2）G-Flamp3探针的荧光光谱和灵敏度的体外表征。研究了纯化蛋白G-

Flamp3的理化性能：1）G-Flamp3的光谱与G-Flamp2相似，荧光激发和发射光谱峰

值分别为490nm和515nm。2）455nm激发下，最大荧光变化（maxΔF/F）为2

0

250%，为G-Flamp2的1.4倍。3）G-Flamp3与cAMP和cGMP的浓度响应关系。G-

Flamp3对cAMP和cGMP的表观解离常数（K）分别为0.57µM和20.27µM，即对

d

cAMP的选择特异性比cGMP高约35倍。

（3）G-Flamp3探针的荧光强度和灵敏度的活细胞内表征。检测了G-Flamp3

在哺乳动物细胞内的表达和荧光强度。G-Flamp3在HEK293T细胞均匀分布且静息

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本研究得到国家重点研发计划（No.2017YFA0700403和No.2021YFF0502904）的支持。

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荧光强度为G-Flamp2的1.34倍。

研究了G-Flamp3在cAMP微弱升高或降低下的荧光变化。1）cAMP浓度微弱

升高：使用15nM异丙肾上腺素（β-肾上腺素受体激活剂）刺激细胞，G-Flamp2和

G-Flamp3的ΔF/F0分别为210%和310%。2）cAMP浓度降低：使用10µM喹吡罗

盐酸盐（多巴胺2型受体激动剂）刺激细胞，G-Flamp2和G-Flamp3的ΔF/F分别为

0

-8%和-43%。

综上所述，