肠道菌群在昼夜节律紊乱导致小鼠认知功能损伤中的作用及机制研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文

摘要

研究背景：阿尔兹海默病（Alzheimersdisease，AD）是一种与年龄相关的神经

退行性疾病，其病理特征包括以Aβ聚集所产生的神经细胞外淀粉样斑块、tau蛋白

过度磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结和神经炎症。在全球范围内，患有阿尔茨海

默氏病或相关的痴呆症者约有4400万人，预计到2050年这一数字将达到约1.35亿

人。睡眠障碍是一种与AD相关的、常见的且往往具有高度破坏性的行为症状。睡眠

节律紊乱一直被认为是AD相关神经退行性变的结果，但近期研究表明，睡眠节律

紊乱很可能在促进AD病理发生的过程中发挥重要作用。目前关注较多的是昼夜节

律紊乱通过促进Aβ病理和tau病理来参与AD的发生，而对神经炎症方面的作用机

制研究较少。此外，越来越多的研究发现肠道菌群通过调节免疫反应参与AD、PD等

神经退行性疾病的发生，肠道菌群的丰度变化存在节律性振荡，研究表明肠道微生物

生态失调和肠上皮屏障渗漏驱动的全身炎症状态和血脑屏障（bloodbrainbarrier，BBB）

缺陷是导致神经炎症和神经退行性变的关键发病机制。节律紊乱是否可通过肠道菌

群失调促进中枢炎症，从而导致AD样认知功能障碍，值得探讨阐明。

目的：本研究旨在探明昼夜节律紊乱对小鼠认知能力的影响，以及肠道菌群失调

介导的神经炎症在这一过程中所起的作用，并进一步探讨干预肠道菌群失调对节律

紊乱导致的认知功能损伤的保护作用。

方法：选取2月龄SPF级C57BL/6J雄性WT小鼠40只，随机分为4组：分别

为对照组（Control，Con)、昼夜节律紊乱组（Circadianrhythmdisruption，CRD）、

对照给予肠道选择性抗生素利福昔明组（Control+Rifaximin，Con+R)、节律紊乱给予

利福昔明组（Circadianrhythmdisruption+Rifaximin，CRD+R)，其中，Con和Con+R

组小鼠每周开关灯时间固定（8:am~8:pm），而CRD和CRD+R组小鼠每周开关灯

时间向后推移6h。此外，Con+R和CRD+R组小鼠在造模的第8周用玉米油溶解的

利福昔明灌胃一周。实验结束后，利用新物体识别实验和巴恩斯迷宫测试来评价小鼠

的认知功能。利用Westernblotting检测海马突触前蛋白（synaptophysin、synapsin1）、

海马突触后蛋白（PSD95、GluR2）和肠和脑紧密连接蛋白（occludin）的水平，利

用肠道菌群测序（16SrRNASeq）和液相色谱-质谱（LC-MS）来检测肠道菌群及代

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谢物的变化、通过检测结肠黏膜杯状细胞分泌的黏蛋白的量、结肠黏膜跨上皮电阻值

以及荧光素异硫氰酸酯-右旋糖酐（FD4）透过结肠粘膜进入血液的量来评价结肠黏

膜屏障的功能。利用ELISA来检测血清及海马促炎细胞因子水平。利用免疫荧光染

色来检测海马小胶质细胞及新生神经元的数目。

结果：体温检测结果显示，CRD小鼠与Con小鼠相比，体温日节律出现异常，

表明已成功建立昼夜节律紊乱小鼠模型。新物体识别实验和巴恩斯迷宫实验结果显

示CRD小鼠空间学习记忆能力降低，而利福昔明可改善小鼠的空间学习记忆能力。

Westernblotting结果显示CRD小鼠脑内tau蛋白磷酸化水平增加，突触相关蛋白水

平降低，而利福昔明可部分逆转该变化。肠道菌群16SrRNASeq测序结果显示，

CRD小鼠与Con小鼠肠道菌群群落的构成发生明显分离，大量有害菌的丰度增多，

如：瘤胃球菌科（f-Ruminococcus），伯克氏菌纲（o-Burkholderiales），萨特氏菌科

（f-Sutterellaceae）和α-变形杆菌目（c-Alphaproteobacteria）；菌群代谢物LC-MS结

果显示，CRD小鼠与Con小鼠的代谢产物发生明显改变，表现为大量脂质分子下调

和大量促炎代谢分子上调；差异微生物-代谢物spearman分析显示，花生四烯酸