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华中科技大学硕士学位论文

钙反应性反式激活子乙酰化修饰及其在神经元

分化中的作用

硕士研究生：何志航

导师：李和教授

华中科技大学同济医学院基础医学院组织与胚胎学系，武汉430030

中文摘要

钙反应性反式激活子（calcium-responsivetransactivator，CREST）是一种在

在人、大鼠、小鼠中高度同源的核蛋白，能通过介导钙依赖性反式激活作用，

实现对特定基因的转录调节。CREST在促进神经元分化成熟及维持成熟神经元

形态和功能中具有重要作用，CREST可募集组蛋白乙酰转移酶（histone

acetyltransferase，HAT）p300，与p53形成功能复合体，促进p300催化p53

K382位点的乙酰化修饰，增强p53与下游神经元细胞周期负调控基因和促分化

相关基因启动子区域的结合能力而实现对相关靶基因的转录激活，进而抑制细

胞周期，促进神经元分化。

无血清诱导小鼠神经母细胞瘤（mouseneuroblastoma，N2a）细胞分化时，

CREST表达上调，其在细胞内的定位也发生显著变化：核蛋白CREST不再局

限于细胞核内，还大量分布于细胞质中，即在N2a细胞分化过程中，定位于核

内的CREST转移到细胞质中。蛋白质表达水平的变化不会改变其在细胞内的定

位，而蛋白质在细胞核和细胞质之间的易位（核-质穿梭）多由该蛋白质翻译后

修饰变化所致。无血清培养诱导N2a细胞分化时的CREST“核-质穿梭”现象

提示，在N2a细胞分化过程中CREST不仅发生表达变化，也可能发生翻译后修

饰变化。

CREST羧基端的谷氨酰胺富集区能够结合并募集组蛋白乙酰转移酶p300和

CBP，促进p300和CBP对特定染色质区域的组蛋白进行乙酰化修饰，解除其与

DNA的结合，从而实现对基因转录的反式激活。此外，CREST还能与组蛋白去

乙酰化酶HDAC1相互作用。乙酰化修饰是一种可逆的翻译后修饰，其主要发生

于蛋白质赖氨酸残基上；对CREST氨基酸序列分析显示，CREST分子上具有4

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个可能进行乙酰化修饰的赖氨酸位点。因此，CREST是一种可能发生乙酰化修

饰的蛋白质。p300、CBP、α微管蛋白（α-tubulin）-N-乙酰转移酶1（α-tubulin-

N-acetyltransferase1,α-TAT1）等HAT不仅对组蛋白进行乙酰化修饰，还催化去

乙酰化酶SIRT2、α-tubulin、p53、p62等多种非组蛋白乙酰化。p300、CBP等

HAT能与CREST相互作用提示，CREST的乙酰化修饰可能通过p300和/或CBP

实现。

为了明确CREST是否通过乙酰化修饰调节神经元分化，本研究在证明

CREST是一种具有乙酰化修饰的蛋白质，明确CREST分子上的乙酰化修饰位

点，鉴定能对CREST进行乙酰化修饰的乙酰转移酶种类的基础上，揭示CREST

乙酰化修饰与其核-质易位的关系和CREST乙酰化修饰对CREST促神经元分化

的作用。

1.无血清分化诱导增强CREST的乙酰化

为了证明CREST是否发生乙酰化修饰，首先检测了内源性CREST的乙酰

化信号。提取未进行分化诱导的N2a细胞蛋白，用抗乙酰化赖氨酸抗体进行免

疫共沉淀（Co-IP），用抗CREST抗体对Co-IP沉淀物进行Westernblot分析，

检测到Co-IP的乙酰化蛋白中含有CREST。进一步，对转染表达重组HA-

CREST的N2a细胞蛋白提取物以抗HA抗体进行Co-IP，应用抗乙酰化赖氨酸

抗体对沉淀物进行Westernblot分析，发现重组表达的HA-CREST可发生乙酰

化。