现代分子生物学第五章.ppt

********************************************************************************************************************5.3.5基因文库的筛选通过某种特定的方法从基因文库中鉴定出含有所需DNA分子的特定克隆过程。1、核酸杂交法（Sourthernblotting）：图5-172、PCR筛选法3、免疫筛选法（Westernblotting）：该法适用于对表达文库的筛选。图5-18第55页，共85页，星期日，2025年，2月5日5.4SNP的理论与应用SNP：singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性。具有很高的遗传稳定性，是继限制性片段长度多态性（RFLP）、RAPD和微卫星DNA（SSR）标记之后的第三代遗传标记。第56页，共85页，星期日，2025年，2月5日RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisma）技术RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。RFLP技术主要包括以下基本步骤：

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。第57页，共85页，星期日，2025年，2月5日第58页，共85页，星期日，2025年，2月5日第59页，共85页，星期日，2025年，2月5日RAPD技术RAPD（(RandomAmplifiedPolymorphicDNA）技术是建立在PCR(PolymeraseChainReaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下,进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。第60页，共85页，星期日，2025年，2月5日第61页，共85页，星期日，2025年，2月5日SSR（simplesequencerepeats）技术微卫星DNA：重复单位序列最短，只有2～6bp，串联成簇，长度50～100bp，又称为短串联重复序列（ShortTandemRepeatSTR)。广泛分布于基因组中。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。第62页，共85页，星期日，2025年，2月5日SNP检测技术传统SNP检测方法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等，最终均需通过凝胶电泳分析，通量受到限制，并只能判断有无，而不知碱基类型。必须进行DNA测序。基因分型：利用数据库已有SNP进行特定人群序列和发生频率研究，包括如下方法：第63页，共85页，星期日，2025年，2月5日1、基因芯片技术：通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交，而不与含有单个错配碱基序列杂交。2、Taqman技术：运用了荧光共振能量转换（FRET）技术。3、分子信标技术：也运用了FRET技术。4、焦磷酸测序法第64页，共85页，星期日，2025年，2月5日SNP的应用1、人类基因单体的绘图2、SNP与疾病易感基因的相关性分析3、指导用药与药物设计第65页，共85页，星期日，2025年，2月5日5.5基因克隆技术在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。第66页，共85页，星期日，2025年，2月5日在分子生物学中，人们把将外源DNA插入具有复制能